Functional characterization of the effector protein SteA of Salmonella Typhimurium through heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Salmonella enterica es un patógeno bacteriano intracelular facultativo que causa una amplia variedad de enfermedades en humanos .La virulencia de S. enterica se basa en la translocación de dos conjuntos de efectores bacterianos en las células huésped a través de sistemas de secreción de tipo 3 codificados por las 2 islas de patogenicidad SPI 1 y SPI 2. SteA está entre el grupo de efectores de Salmonella que pueden ser translocados tanto por el T3SS de la SPI 1 como el de la SPI 2. Los mutantes carentes de este efector en S. Typhimurium muestran atenuación de la virulencia en modelos murinos de infección sistémica. Sin embargo, a pesar de su importancia para la patogénesis de S. Typhimurium, se han publicado pocos estudios sobre la función de SteA. Se ha descrito que SteA se localiza en la red trans Golgi cuando se expresa ectópicamente en células de mamífero no infectadas o se secreta por S. Typhimurium en células infectadas Además, SteA contribuye al control de la dinámica de la membrana de la SCV y a la formación de SIFs, ya que las células infectadas con un mutante faltando steA muestran menos SIFs, aumento de la agrupación de SCVs y vacuolas morfológicamente anormales que contienen más de una bacteria. Desde hace más de cincuenta años se ha utilizado a la levadura S. cerevisiae como organismo modelo para el estudio de procesos celulares de células eucarióticas. Entre las posibles aplicaciones del modelo de levadura se encuentra la caracterización funcional de efectores bacterianos que son secretados por el T3SS para modificar los procesos celulares con el objetivo de permitir la supervivencia del patógeno y contribuir a la enfermedad. La expresión de los efectores bacterianos en la levadura a menudo da lugar a una variedad de fenotipos o alteraciones del crecimiento, que pueden dar pistas sobre sus funciones en la célula hospedadora y su papel en la patogénesis. La sobreexpresión de SteA en S. cerevisiae causó una inhibición significativa del crecimiento celular, acompañado de alteraciones en la morfología mitocondrial caracterizada por la aparición de mitocondrias condensadas. Este estudio ha permitido asignar un papel funcional al dominio amino terminal de SteA, ya que los efectos observados eran dependientes de esta dicha región. Nuestros resultados mostraron que SteA se localiza tanto en la membrana plasmática como en la vacuola cuando se expresa en levadura, y que los fosfoinositidos son marcadores diferenciales para la localización en dichas membranas celulares. Se encontró que la localización de SteA en la levadura depende de su capacidad de unirse al fosfoinositido PI4P generado por Stt4. Sorprendentemente, la sonda del PI4P, P4C, derivada del efector de Legionella SidC, no marcó la vacuola pero mostró más localización en la MP cuando se co expresó con SteA que cuando se expresó sola, lo que sugiere que SteA podría estar regulando los niveles de PI4P en S. cerevisiae. Nuestros resultados mostraron que SteA no se localiza en la vacuola en mutantes vps de la clase D y E, afectados en las proteínas de los complejos CORVET y ESCRT respectivamente. En su lugar, se acumuló en un compartimiento adyacente a la vacuola que co localizó con el marcador de las endosomas tardios en los mutantes vps de clase E, o en puntos de diferente naturaleza en mutantes vps de clase D. Estos resultados indican que SteA está dirigido a la vacuola a través del MVB. La sobreexpresión de SteA muestra interacciones genéticas con mutaciones en genes relacionados con la homeostasis de las vacuolas. Todos estos hallazgos relacionados con la expresión de este efector de Salmonella en células de levadura, junto con la interacción específica de SteA con PI4P, indican que es probable que SteA interfiera con varios procesos relacionados con el tráfico de la membrana en células eucarióticas.