Nuevas estrategias de espectrometría de masas para la obtención y cuantificación de bioimágenes de platino y determinación de proteínas ligadas a fármacos platinados en estudios de nefrotoxicidad

Resumen

Desde que en los años 70 se descubriese fortuitamente la actividad antineoplásica del cisplatino, éste ha sido empleado con gran éxito en el tratamiento de numerosos tumores. Sin embargo, en su aplicación surgen diversos inconvenientes como la aparición de resistencias al fármaco o la aparición de efectos secundarios. Entre estos últimos destaca la nefrotoxicidad, la cual limita la dosis administrable del fármaco. Por ello, otros fármacos de Pt de segunda y tercera generación han sido desarrollados con el fin de mejorar sus propiedades. La actividad antineoplásica del cisplatino se debe a su interacción con su diana farmacológica principal, el ADN. Sin embargo, éste puede unirse a otras biomoléculas como las proteínas. Esta interacción es de gran importancia, ya que puede dar información sobre su mecanismo de toxicidad y de aparición de resistencia al fármaco y efectos secundarios. Por ello, el estudio de dichas interacciones puede arrojar cierta luz a la comprensión de los mecanismos de aparición de nefrotoxicidad. El objetivo de esta tesis doctoral ha consistido en el desarrollo de estrategias bioanalíticas basadas en espectrometría de masas atómica y molecular, técnicas de separación electroforéticas y nuevos métodos de preparación de la muestra para la determinación de proteínas ligadas a fármacos de Pt en muestras biológicas relacionadas con el fracaso renal, así como para la obtención de mapas de distribución de Pt en tejidos afectados. En primer lugar, se han evaluado las condiciones óptimas para la separación mediante PAGE y OFFGEL IEF de Pt proteínas. Además, se desarrolló una metodología para abordar la digestión enzimática de los complejos de Pt mediante el método FASP. También, se abordó una aproximación shotgun en la que los complejos Pt proteína fueron digeridos mediante el método FASP, seguido de su separación a nivel de péptidos mediante OFFGEL IEF, lo que permitió mejorar la identificación de la unión del cisplatino a las proteínas. Por otro lado, para facilitar la identificación de los puntos de unión entre Pt y proteínas, se ha desarrollado una estrategia para la obtención de un ión marcador específico de Pt, que permitió una sencilla localización de péptidos ligados a Pt dentro de la gran complejidad de las carreras cromatográficas, lo cual es de gran interés para la identificación de proteínas ligadas a Pt en muestras biológicas. Finalmente, se estudió la distribución de cisplatino, carboplatino y oxaliplatino en muestras de riñones de ratas tratadas con los mismos, mediante la técnica de LA ICP MS. Para ello, fue necesario el desarrollo de una estrategia de estandarización interna de la señal que permitiera obtener bioimágenes comparables entre diferentes tejidos y diferentes sesiones de medida. El método desarrollado consistió en la impresión de disoluciones que contenían el patrón interno sobre la superficie de las láminas de tejido. Con este procedimiento se obtuvieron bioimágenes normalizadas, lo que permitió comparar las diferentes distribuciones de los tres fármacos en el riñón. En este punto, se observó que mientras cisplatino y carboplatino se distribuían principalmente por la zona cortical del riñón, el oxaliplatino se distribuía de forma más o menos homogénea a lo largo de toda la lámina, lo cual podría estar relacionado con su comportamiento no nefrotóxico. Por otro lado, siguiendo el mismo procedimiento de impresión, se desarrolló una estrategia de cuantificación de bioimágenes mediante la adición de un patrón enriquecido isotópicamente y la posterior cuantificación de las imágenes por dilución isotópica, que permitió cuantificar las diferencias en la cantidad de fármaco presente en las zonas cortical y medular para los tres fármacos de Pt mencionados anteriormente, mostrando que tanto cisplatino como carboplatino (a diferencia del oxaliplatino) presentan una concentración de Pt en la corteza muy superior a la encontrada en la médula.