Aislamiento y caracterización del gen de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa de saccharomyces cerevisiae

Resumen

La fosfoenolpiruvato carboxikinasa (pck) es uno de los enzimas característicos de la vía gluconeogenica en la levadura s. Cerevisiae. Este enzima esta regulado por los procesos de represión e inactivación catabólica, cuyos mecanismos son todavía poco conocidos en levadura. Con el fin de investigar las bases moleculares de estos fenómenos, llevamos a cabo la clonación del gen de dicho enzima. La clonación se realizo por complementación de un mutante de levadura (pck-1) carente de actividad pck, utilizando una genoteca genómica de levadura. Se aisló un fragmento de dna de 7,9 kb capaz de complementar dicha mutación, y se redujo hasta un tamaño d 2,2 kb manteniendo la complementación. La hibridación de rna total con una sonda interna al gen pck-1 mostro un mrna de 2,1 kb, que solo se acumula en condiciones de represión, indicando que la represión catabólica de la pck ocurre básicamente a nivel transcripcional. Durante la subclonación se observo que la eliminación de un fragmento d 4 kb disminuía tres veces la expresión de la actividad y que la posterior reducción hasta 2,2 kb lleva aparejada una disminución de la expresión aun mayor y una alteración en el patrón de desrepresión. Estos resultados indican la existencia de zonas reguladoras en estos fragmentos. Se ha observado que en cepas transformadas con plásmidos que contienen múltiples copias del gen pck-1 la inactivación catabólica de la pck se encuentra enlentecida con respecto a una cepa control, lo que sugiere que el sistema inactivante se encuentra en cantidad limitante.