Replicación del ADN mitocondrial humano a nivel de moléculas individualessíntesis de la cadena retrasada

Resumen

La mitocondria es un orgánulo celular esencial para el metabolismo celular. Produce el ATP y juega un papel fundamental en procesos relacionados con la señalización celular, apoptosis y envejecimiento celular. Es el único orgánulo que presenta su propio genoma, del que existen multitud de copias distribuidas por toda la mitocondria. Su correcta expresión es fundamental por lo que una replicación ineficiente y/o poco fiel del ADN mitocondrial (mtDNA) está relacionada con el desarrollo de tipos específicos de cáncer, envejecimiento prematuro o la aparición de enfermedades mitocondriales; desordenes metabólicos y neurodegenerativos crónicos Tres componentes forman el replisoma mitocondrial mínimo en humanos; la helicasa TWINKLE, que abre la cadena doble del ADN (dsDNA) en dos hebras sencillas (ssDNA); una de las cuales, la hebra líder, es utilizada como molde por la polimerasa mitocondrial (PolG) para producir dsDNA, y la otra, la desplazada, es rápidamente recubierta por la mtSSB, o SSB mitocondrial. Cuando la replicación de la hebra líder ha alcanzado dos terceras partes del total, comienza la replicación de la hebra desplazada, donde la PolG debe replicar un sustrato de ssDNA recubierto por la mtSSB. Estas proteínas reúnen una función vital, y mutaciones en su secuencia se asocian con alteraciones en la función mitocondrial y enfermedades neurodegenerativas, migrañas, epilepsia o Parkinson. El desarrollo de técnicas de manipulación de moléculas a nivel individual, como las pinzas ópticas, permite seguir la actividad de una sola proteína en tiempo real identificando la dinámica y cinética del proceso. Además, permiten medir y ejercer fuerzas mecánicas sobre el sistema bajo estudio, y analizar así su mecano-química y mecanobiología. El objetivo principal de esta tesis es utilizar las pinzas ópticas para estudiar la organización de los complejos ssDNA-mtSSB que se generan durante la replicación, donde la mtSSB se ha unido al ssDNA con gran afinidad. La mtSSB es un tetrámero que organiza el material genético uniendo un número variable de nucleótidos en varios modos de unión, que podrían seleccionarse de forma preferente en función del proceso celular. Nosotros hemos estudiado los modos de unión de la mtSSB al ssDNA utilizando dos condiciones experimentales: unión a un ssDNA que ha sido previamente generado, y unión a un ssDNA que es generado de forma gradual mientras tiene lugar la replicación in situ. Cuando la unión se produce en el primer caso, la mtSSB lo organiza en dos modos de unión principales uniendo 35 y 70nt aproximadamente, cuya prevalencia depende de la concentración de sal y proteína. Si la unión de la mtSSB tiene lugar de forma acoplada con la síntesis de ADN predomina el modo más bajo, lo que prepara el sustrato de ADN para la replicación. También hemos estudiado la acción coordinada de la mtSSB y PolG durante la síntesis de la cadena desplazada. Analizamos el efecto de la mtSSB parental y SSB no parentales en la cinética de replicación de PolG y comprobamos que la mtSSB estimula la cinética en tiempo real de la polG al eliminar la estructura secundaria del ssDNA. También demostramos que para desplazar la mtSSB deben establecerse interacciones funcionales específicas PolG-mtSSB, cuya magnitud permite a la polimerasa expulsar activamente la mtSSB del ssDNA molde haciendo que no sea un impredimento en la replicación. Además, hemos comprobado que otros sistemas de replicación como el del bacteriófago T7 usan mecanismos semejantes para desplazar la SSB parentales unidas al ADN, lo que sugiere que este mecanismo podría ser extrapolable otros sistemas biológicos similares. En esta tesis se han sentado las bases para futuros estudios de replicación del ADN mitocondrial, que podrán arrojar luz sobre sus mecanismos de funcionamiento y su relación con enfermedades mitocondriales, tan desconocidas hasta ahora. Además, en este trabajo se han desarrollado herramientas físico-matemáticas que serán de gran utilidad en el campo.