Desarrollo de (nano)biosensores enzimáticos de fluorescencia dirigidos a la monitorización mínimamente invasiva de glucosa

Resumen

La monitorización de los niveles de glucosa en sangre es esencial en el tratamiento y control de la diabetes. Dado el interés socio-económico que la determinación de este parámetro clínico supone, el desarrollo de sistemas sensores que permitan su monitorización de forma mínimamente invasiva constituye un reto científico de primer nivel [1]. El desarrollo de este tipo de sistemas requiere resolver tres problemas importantes: 1) el acceso a la muestra; 2) disponer de un receptor bioquímico adecuado, y 3) implementarlo sobre un soporte físico biocompatible. Estos tres aspectos se han tenido presentes a la hora de abordar el objetivo general de esta tesis doctoral, que consiste en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para la determinación de glucosa que puedan ser implementadas en sistemas de monitorización no invasivos. Una forma de resolver el primer problema es realizar la determinación sobre fluidos biológicos más accesibles. Una alternativa interesante es el análisis en los fluidos intersticiales del tejido subcutáneo cuya concentración de glucosa está relacionada con su valor en sangre [2, 3]. En cuanto al segundo problema, la enzima glucosa oxidasa (GOx) posee propiedades ópticas que cambian reversiblemente durante la reacción enzimática (propiedades autoindicadoras) y, por tanto, su elección como biorreceptor permite cumplir los requisitos exigibles a estos sistemas de monitorización [4]. - Estudio de las propiedades ópticas autoindicadoras de GOx (Capítulo 3) Las propiedades autoindicadoras intrínsecas e inducidas de GOx (principalmente de fluorescencia) se estudian en detalle en el Capítulo 3. La fluorescencia intrínseca debida al cofactor FAD no resultó de utilidad analítica, debido a su débil intensidad. Sin embargo, la modificación de la enzima con un fluoróforo basado en Ru(II) permitió obtener cambios durante la reacción enzimática proporcionales a la concentración de glucosa. La señal analítica se explica como consecuencia del efecto desactivador del O2, que se consume durante la reacción. Asimismo se desarrolló un modelo matemático que justifica esta señal. Esta nueva metodología se añade a otras descritas anteriormente (fluorescencia del aminoácido triptófano y fluorescencia inducida mediante un derivado de fluoresceína) para su aplicación en el desarrollo de sistemas sensores. Por último, puesto que el sistema sensor requiere un soporte físico en el que se encuentre inmovilizado el elemento de reconocimiento, se estudiaron diferentes materiales o soportes para el diseño de biosensores implantables basados en GOx, cuyos resultados se recogen en los capítulos 4-6. - Nanopartículas magnéticas como base para el diseño de nanobiosensores ópticos (Capítulo 4) Las posibilidades que ofrece la nanotecnología son de gran interés a la hora de considerar la implantación del sensor en el organismo. Las nanopartículas magnéticas (NP) pueden ser dirigidas mediante campos magnéticos y así permitir la detección de analitos en zonas concretas del organismo. NP, tanto comerciales (Chemicell) como sintetizadas en el laboratorio [5], que poseen recubrimientos poliméricos para la inmovilización de biomoléculas, se emplearon como soporte sólido para GOx. Principalmente, fue necesario resolver dos problemas relacionados con: 1) la estabilidad de la unión enzima-NP; 2) las propiedades ópticas de las NP (absorción y dispersión) que dificultan la medida de la fluorescencia. El uso de una enzima modificada para la que se ven incrementados el número de grupos funcionales NH2 disponibles para la unión (GOxsam) permitió conseguir inmovilizaciones estables. Las NP de pequeño tamaño (8 nm), denominadas PMAO [5], resolvieron los problemas relacionados con la detección de la fluorescencia (la dispersión se minimiza) y permitieron la determinación de glucosa en un rango que se extiende hasta 2,6 mM utilizando GOxsam químicamente modificada con el fluoróforo FS. - Nanobiosensores basados en las propiedades de fluorescencia upconversion de vidrios de fluorohafnato y nanopartículas (Capítulo 5) Los materiales que presentan fluorescencia de tipo upconversion (materiales UC) son capaces de convertir radiación láser del infrarrojo cercano (NIR) en luz visible y, por tanto, su aplicación en sensores no invasivos tiene un gran potencial al permitir el uso de la ventana espectral del NIR, donde la absorción de los tejidos es baja y la autofluorescencia de la matriz se minimiza [6]. Durante esta Tesis Doctoral, se han estudiado dos materiales UC: nanopartículas (UCLNP [7]) y vidrios de fluorohafnato (vidrios UC [8]), cuyas propiedades se pueden combinar con las de la enzima de acuerdo con dos esquemas de utilidad en el diseño de sensores para la determinación de glucosa: 1) utilizando GOx y las propiedades de absorción de su cofactor FAD, que puede producir un efecto de filtro interno sobre la fluorescencia UC; y 2) tras la modificación química de la GOx un fluoróforo (GOx-FS) que absorbe la radiación UC; el material actúa como fuente de excitación de la FS permitiendo observar la fluorescencia del fluoróforo y sus cambios durante la reacción enzimática. Los mejores resultados se obtuvieron empleando GOx-FS y UCLNP. Se utilizaron láminas de poliacrilamida como soporte físico para la inmovilización de enzima y nanopartículas y un sistema FIA (análisis por inyección en flujo) para las medidas. Tras la optimización de los parámetros físicos y químicos que afectan a la señal analítica, el biosensor desarrollado responde linealmente a glucosa en el rango comprendido entre 3,3 y 16,6 mM y se mantiene estable al menos durante 9 días. Asimismo, se ha demostrado que los vidrios pueden constituir una alternativa novedosa para la fabricación de sistemas de medida de la fluorescencia (celdas, cubetas, placas¿), que permitirían el seguimiento de reacciones enzimáticas. - Biosensores basados en hidrogeles de poliacrilamida (Capítulo 6) Los hidrogeles de poliacrilamida se utilizan frecuentemente en medicina estética como material de relleno subcutáneo. Son biocompatibles y muy duraderos por lo que constituyen una alternativa para la implantación del biosensor bajo la piel [9]. La GOx modificada químicamente con un derivado de fluoresceína (GOx-FS) y funcionalizada con grupos acrilato (para mejorar la estabilidad de la inmovilización) se incorporó a hidrogeles de poliacrilamida sintetizados con unas características físicas muy similares a los comerciales. Trabajando en modo FIA se obtuvieron señales estables durante una semana (dos medidas diarias). El rango lineal se extiende hasta 15,6 mM (DER=5%). Adicionalmente se realizaron medidas en modo continuo que simulan las variaciones que se producen en el organismo. Finalmente, se realizaron los primeros ensayos in vivo en ratones, a los que se inyectó subcutáneamente el hidrogel sintetizado. Utilizando un sistema de imagen (Ivis Lumina) fue posible observar la fluorescencia de GOx-FS. La modificación adicional del hidrogel con el fluróforo Cy5.5 fue asimismo evaluada, lo que permitió utilizar su fluorescencia como referencia, ya que esta no se encuentra afectada por la reacción enzimática con glucosa. Referencias 1. Steiner, M.S., Duerkop, A., Wolfbeis, O.S., Optical methods for sensing glucose. Chem. Soc. Rev., 2011. 40(9), 4805-4839. 2. Girardin, C.M., Huot, C., Gonthier, M., Delvin, E., Continuous glucose monitoring: a review of biochemical perspectives and clinical use in type 1 diabetes. Clin. Biochem., 2009. 42(3), 136-142. 3. Weidemaier, K., Lastovich, A., Keith, S., Pitner, J.B., Sistare, M., Jacobson, R., Kurisko, D., Multi-day pre-clinical demonstration of glucose/galactose binding protein-based fiber optic sensor. Biosens. Bioelectron., 2011. 26(10), 4117-4123. 4. Galbán, J., Sanz-Vicente, I., Ortega, E., del Barrio, M., de Marcos, S., Reagentless fluorescent biosensors based on proteins for continuous monitoring systems. Anal. Bioanal. Chem., 2012. 402(10), 3039-3054. 5. Moros, M., Pelaz, B., Lopez-Larrubia, P., Garcia-Martin, M.L., Grazu, V., de la Fuente, J.M., Engineering biofunctional magnetic nanoparticles for biotechnological applications. Nanoscale, 2010. 2(9), 1746-1755. 6. Mader, H.S., Kele, P., Saleh, S.M., Wolfbeis, O.S., Upconverting luminescent nanoparticles for use in bioconjugation and bioimaging. Curr. Opin. Chem. Biol., 2010. 14(5), 582-596. 7. Del Barrio, M., de Marcos, S., Cebolla, V., Heiland, J., Wilhelm, S., Hirsch, T., Galban, J., Enzyme-induced modulation of the emission of upconverting nanoparticles: Towards a new sensing scheme for glucose. Biosens. Bioelectron., 2014. 59C, 14-20. 8. Chamarro, M.A., Cases, R., Energy up-conversion in (Yb, Ho) and (Yb, Tm) doped fluorohafnate glasses. J. Lumin., 1988. 42(5), 267-274. 9. Bello, G., Jackson, I.T., Keskin, M., Kelly, C., Dajani, K., Studinger, R., Kim, E.M., Lincoln, D., Silberberg, B., Lee, A., The use of polyacrylamide gel in soft-tissue augmentation: an experimental assessment. Plast. Reconstr. Surg., 2007. 119(4), 1326-1336.