Células nk, linfocitos t cd8+ y el mecanismo de exocitosis granular en la regulación de la inflamación durante la interacción patógeno-huésped en sepsis bacteriana

  1. ARIAS CABRERO, MAYKEL ALBERTO
Dirigida por:
  1. Julián Pardo Director/a
  2. María Pilar Jiménez de Bagüés Picazo Director/a

Universidad de defensa: Universidad de Zaragoza

Fecha de defensa: 06 de junio de 2017

Tribunal:
  1. Carlos Martín Montañés Presidente/a
  2. Pablo Pelegrin Vivancos Secretario/a
  3. Carlos Fernández-Ardavín Castro Vocal

Tipo: Tesis

Teseo: 479213 DIALNET

Resumen

Introducción y antecedentes: La sepsis es uno de los problemas de salud más importantes que ha enfrentado la humanidad y continúa siéndolo en la actualidad. Se estima que, anualmente se producen alrededor de 30 millones de casos de sepsis y 5 millones de muertes por esta causa (Fleischmann et al., 2016). En Europa, el estudio SOAP (del inglés, “Sepsis Ocurrence in Acutelly ill Patients”) demostró que la sepsis es la principal causa de ingreso en los servicios de cuidados intensivos no coronarios (Vincent et al., 2006). Se define Sepsis como “la disfunción orgánica causada por una respuesta anómala del huésped a la infección que supone una amenaza para la supervivencia” (Singer et al., 2016). Las células NK y los linfocitos Tc juegan un papel fundamental en la respuesta frente a un patógeno. Por un lado, van a ser responsables de la eliminación de las células infectadas. Por otro lado, pueden estar implicadas en el daño asociado a sepsis, al ser una importante fuente de citoquinas proinflamatorias, o al regular su producción por otros grupos celulares. La activación del sistema inmune innato, resultado de la detección de MAMPs o DAMPs, constituye la primera línea de defensa del sistema inmunológico (de Diego et al., 2007; Martinon et al., 2009). Este proceso provoca la producción de citoquinas proinflamatorias como IFN tipo I, IL-6, IL-1 o TNF. Estas citoquinas contribuyen a la eliminación de patógenos intracelulares de un modo directo, o mediante la activación de otros componentes del sistema inmune como las células NK y los linfocitos Tc. Las células NK y los linfocitos Tc median la eliminación de patógenos intracelulares mediante la inducción de muerte celular a través de ligandos de muerte o de la vía de la exocitosis granular (Russell and Ley, 2002). La apoptosis o muerte celular programada constituye una de las principales líneas de defensa frente a patógenos intracelulares, porque su activación priva a los patógenos de su nicho de replicación. Debido a esto muchos patógenos intracelulares han desarrollado mecanismos de inhibición de la muerte celular para facilitar su replicación (Finlay and McFadden, 2006; Ashida et al., 2011). La vía de exocitosis granular presente en las células NK y en los linfocitos Tc constituye un segundo estímulo de apoptosis que puede ser importante en la eliminación de células infectadas (Pardo et al., 2009). Este mecanismo consiste en un proceso de transferencia mediante el cual los linfocitos liberan perf y gzms. La perf ejerce su acción permitiendo el paso de las gzms al interior celular. Se ha asumido tradicionalmente que todas las gzms actúan como proteasas citotóxicas. Sin embargo, evidencias recientes sugieren que la gzmB es la que principalmente ejerce funciones citotóxicas, mientras otras granzimas como la gzmA, la gzmK y la gzmM, actuarían como mediadores proinflamatorios (Froelich et al., 2009; Pardo et al., 2009; Anthony et al., 2010; Cooper et al., 2011; Catalan et al., 2015). La gzmA es capaz de inducir la producción de las citoquinas proinflamatorias como IL-1β, TNF e IL-6 en monocitos humanos y mecrófagos de ratón (Metkar et al., 2008). También se ha demostrado en modelos de endotoxemia por LPS, que la ausencia de gzmA o gzmM incrementa la supervivencia de los ratones deficientes en estas gzms en comparación con ratones wt (Metkar et al., 2008; Anthony et al., 2010). En pacientes con sepsis se han encontrado niveles elevados en suero de gzmA, gzmB y gzmK (Lauw et al., 2000; Rucevic et al., 2007). Los modelos de endotoxemia por LPS no son capaces de reproducir todos los eventos que se producen en la sepsis, por lo que se necesitan utilizar otros modelos animales en los que se desarrollen los signos clínicos de sepsis después de la exposición a patógenos bacterianos endógenos. Brucella microti es un nuevo miembro del género Brucella que fue aislado de un roedor salvaje, Microtus arvalis (Scholz et al., 2008). Esta bacteria es un patógeno intracelular capaz de replicarse en macrófagos y, a diferencia de otros miembros del género Brucella, induce sepsis en ratones (Jimenez de Bagues et al., 2010). Estas características convierten a Brucella microti en una herramienta útil para estudiar el papel de la exocitosis granular tanto en el control del patógeno, como en la fisiopatología de la sepsis en ratones. Uno de los modelos de ratón que mejor mimetiza la sepsis en humanos es la peritonitis inducida por CLP (Buras et al., 2005). Con este modelo se logran perfiles de citoquinas similares a la de la sepsis en humanos; además, se reproducen las fases hiperinflamatoria y de inmunosupresión, tal y como sucede durante la sepsis en humanos (Buras et al., 2005; Nemzek et al., 2008). Objetivo: El objetivo de esta tesis ha sido establecer la relevancia fisiológica del mecanismo de exocitosis granular en la regulación de la inflamación durante la interacción patógeno-huésped en sepsis bacteriana inducida por Brucella microti o por peritonitis inducida mediante ligadura y punción del ciego. Resultados: Cuando se infectan ratones B6 con una dosis subletal de B. microti por vía ip, encontramos que las células NK no participan en el control del patógeno, mientras que los linfocitos Tc sí tiene un papel relevante. Hemos encontrado que, in vivo, la perforina y la granzima B son importantes para la eliminación adecuada de la bacteria, mientras que la granzima A y el sistema Fas/FasL no son necesarios en el control de la infección por B. microti. Además, in vivo, el IFNγ es crucial en la supervivencia y el control de la infección por B. microti en ratones. Por otro lado, observamos que, ex vivo, los linfocitos Tc utilizan perforina y granzima B para inducir apoptosis y para inhibir la replicación de B. microti en macrófagos derivados de la médula ósea infectados con esta bacteria, mientras que la granzima A no es citotóxica y no es necesaria para inhibir la replicación de B. microti en macrófagos infectados. Los ratones deficientes en granzima A mostraron una mayor resistencia a la sepsis inducida por B. microti, mientras que los ratones deficientes en perforina y/o granzima B presentan una susceptibilidad similar a los ratones control. El incremento en la supervivencia de los ratones deficientes en granzima A durante la sepsis inducida por B. microti se acompaña de una menor producción de citoquinas proinflamatorias con relevancia en sepsis tales como IL-1, TNF, IL-6 y MIP-1. También comprobamos que las células NK juegan un papel relevante en la sepsis inducida por B. microti y que estas células son una fuente importante de granzima A durante la sepsis inducida por este patógeno. Teniendo en cuenta el papel de la granzima A expresada en células NK, durante la sepsis bacteriana inducida por Brucella microti, nos preguntamos ¿qué papel juega esta proteasa en un modelo de sepsis inducida por ligadura y punción del ciego?, un modelo más estricto de sepsis y que mejor mimetiza la respuesta séptica en humano. Nuestros resultados mostraron que esta proteasa es capaz de inducir inflamación en macrófagos y que la ausencia de granzima A aumenta la supervivencia en los ratones sometidos a sepsis inducida por CLP. Además, comprobamos que el incremento de la supervivencia en los ratones deficientes en granzima A sometidos a CLP se asocia a una menor producción de IL-1β, TNF e IL-6, y que la granzima A en macrófagos estimulados con LPS, induce la producción de IL-1β por un mecanismo dependiente de caspasa-1 e incrementa la producción de TNF mediada por LPS. Conclusiones: Hemos demostrado que las granzimas B y A, expresadas por las células Tc y NK, contribuyen a la inmunopatogénesis bacteriana en dos modelos murinos de sepsis bacteriana. La gzmA, se puede ser una diana terapéutica interesante para tratar la sepsis sin comprometer la capacidad del sistema inmune. Este hallazgo abre la posibilidad de tratar la sepsis inflamatoria sin causar inmunosupresión.