Proteasas digestivas de tipo tripsina del taladro del maíz, "Sesamia nonagrioides" (Lepidoptera, Noctuidae), caracterización e interacción con la proteína insecticida Cry1Ab

Resumen

Una de las plagas de insectos con mayor incidencia económica sobre el cultivo de maíz en el área Mediterránea es el taladro del maíz, Sesamia nonagrioides (Lepidoptera, Noctuidae). El maíz transgénico resistente a taladros que expresa un fragmento de la proteína insecticida Cry1Ab de la bacteria Bacillus Thuringiensis (Bt), comercializado en España desde 1998, ofrece una alternativa al uso de insecticidas químicos para el control de esta plaga. El mayor problema que puede presentar la tecnología de plantas transgénicas aplicadas al control de plagas es la aparición de insectos resistentes. Las proteasas digestivas de tipo tripsina pueden estar implicadas en la aparición de resistencia, por su papel fundamental en la activación proteolítica de las toxinas Cry, y porque pueden ser responsables de su degradación proteolítica. El conocimiento previo de la diversidad de proteasas en S.nonagrioides y su interacción con Cry1Ab permitiría identificar los posibles mecanismos de resistencia mediados por proteasas que se pudieran desarrollar en poblaciones de campo. Se han purificado cuatro tipsinas (T, TIIA, TIIB y TIII) a partir de extractos digestivos de larvas de último estadio de S.nonagrioides mediante cromatografía de afinidad. Los extractos digestivos se separaron en fracciones utilizando una columna de benzamidina-sefarosa 6B. La primera fracción que eluyen de la columna es la de proteínas no retenidas (PNR) que contienen principalmente quimiotripsinas y elastasas. Posteriormente eluyen las cuatro tripsinas en diferentes pasos del gradiente de benzamidina. Mediante el estudio de la huella peptídica y la secuencia N-terminal de las tripsinas purificadas se han podido correlacionar las tripsinas activas purificadas con las secuencias de ADNc obtenidas anteriormente. Estas tripsinas pertenecen a tres grupos filogenéticos bien diferenciados de secuencias de tripsinas conservadas en lepidópteros, tipos I, II y III. Las tripsinas TI y TIIA corresponden a las tripsinas I y II purificadas previamente, mientras que las tripsinas TIIB y TIII han sido purificadas por primera vez en este trabajo. La existencia de tripsinas de tipo III había sido purificada una tripsina de este tipo en lepidópteros. Las tripsinas TI, TIIA y TIII se han caracterizado y comparado con las tripsinas ya conocidas, analizando el peso molecular, el punto isoeléctrico, la actividad con distintos substratos y la respuestas frente a inhibidores. TI, TIIA y TIII presentan pesos moleculares de 26, 168, 24, 486 y 17,953 KDa, respectivamente. Las tripsinas TI y TIII son aniónicas, presentan puntos isoeléctricos de 6,0 y 5,0 respectivamente, mientras que las tripsina TIIA es catiónica, estando su punto isoeléctrico a pH 8,7. Los tres tipos de tipsinas mostraron su óptimo de actividad a pHs alcalinos siendo TIIA la más activa utilizando BApNA como substrato. Asimismo, las tripsinas TI, TIIA y TIII han sido caracterizadas cinéticamente por su preferencia por substratos con lisina o arginina, observándose cinéticamente por su preferencia por substratos con lisina o arginina, observándose una mayor preferencia por arginina en los tres tipos de tripsinas. Las tripsinas TI, TIIA y TIII muestran diferencias en cuanto a la susceptibilidad frente a inhibidores. Así, TI es inhibida diferencialmente por E-64, mientras que TIIA es inhibida por HgCl2 y LBI. Sin embargo, con ninguno de los inhibidores probados se ha encontrado inhibición específica para TIII. El inhibidor HgCl2, específico de TII, inhibide de forma diferencial la actividad de tipo tripsina en extractos digestivos de distintos estadios larvarios, sugiriendo que la presencia de tripsinas de tipo II es predominante en los estadios más avanzados de desarrollo. La producción de tripsinas en sistemas de expresión heteróloga (Escherichia coli y Pichia pastoris) se ha ensayado como una alternativa al método de purificación de tripsinas a partir de extractos digestivos. El sistema que ha dado mejor resultado en la expresión de tripsina I recombinante ha sido el de E.coli. A partir de los cuerpos de inclusión de esta bacteria, utilizando agentes desnaturalizantes, se ha purificado la tripsina I. El método de expresión debe ser optimizado, ya que no se ha conseguido producir la enzima en su forma activa. Se ha estudiado la interacción de las tripsinas (TI, TIIA y TIII) purificadas de S.nonagrioides con la proteína Cry1Ab de B.thuringiensis, para conocer el papel de las proteasas digestivas de S.nonagrioides en el procesamiento o degradación de la toxina Cry1Ab. La digestión de Cry1Ab con TI o TIII resultó en un patrón de procesamiento similar, generando fragmentos tóxicos de 69-67 KDa. Con TIIA se obtiene un procesamiento posterior que resulta en fragmentos de 46-43 KDa. La digestión de la toxina con PNR que contiene principalmente quimotripsinas y elastasas, resultó en un patrón de procesamiento diferente dando lugar a un fragmento predominante de 70 KDa. La digestión con el extracto digestivo completo, a los cinco minutos de reacción produce un patrón e procesamiento que representa la combinación de la digestión obtenida con PNR y tripsinas purificadas, sugiriendo que todas las proteasas están implicadas en los primeros pasos del procesamiento. Sin embargo, el patrón de fragmentos de Cry1Ab obtenidos en tiempos de incubación mayores (1 hora y 24 horas) fue muy similar al que se obtiene con las tripsinas purificadas, lo que indica la importancia de la digestión mediada por tripsinas en los últimos pasos del procesamiento de Cry1Ab. Los productos de la digestión de Cry1Ab con proteasas (extracto digestivos completos, PNR o tripsinas TI, TIIA y TIII), incluida la proteína de 46-43 KDa, resultaron igual de tóxicos que la toxina nativa frente a larvas neonatas de S.nonagrioides, lo que indica que ninguna de ellas es capaz de degradar a la toxina. Se han realizado bioensayos con larvas neonatas para comprobar la susceptibilidad de S.nonagrioides frente a las siguientes toxinas: CryAa, Cry1Ac, Cry1Ba, Cry1Ca, Cry1Da, Cry1Fa, Cry1Ja y Cry2Aa. Las proteínas Cry que provocan los porcentajes más altos de mortalidad en larvas neonatas de S.nonagrioides con Cry1Ac, Cry1Ca y Cry1Fa. Con estas toxinas se han llevado a cabo bioensayos para calcular los valores de la concentración letal que provoca un 50% de mortalidad (CL50). Según estos resultados, y otros estudios complementarios de unión a receptores llevados a cabo con la mismas toxinas, se podría considerar la expresión piramidal de Cry1Ab y Cry1Fa en la misma planta de maíz Bt como una alternativa a largo plazo para el control de taladros del maíz.