GRK2 as new onco-modulator of breast tumoural transformation through the regulation of the p53/Mdm2 axis

Resumen

The complex interactome of GRK2 points to this kinase as a key node in the signal transduction network of the cell, contributing to the proper functioning of basic cellular processes such as cellular migration, cell cycle progression or angiogenesis. Both GRK2 expression levels and activity are frequently found unbalanced in diverse diseases, thus suggesting a role for this kinase in aberrant cellular processes related to the onset or development of these pathologies. In the present work, we have extensively characterized the role of GRK2 as a novel onco-modulator of breast tumoural transformation, with particular focus on its impact in the Mdm2/p53 axis and /or in HDAC6-mediated responses. We have determined that high-amplification of ErbB receptors such as EGFR or Her2 and over-activation of the PI3K/AKT axis as a result of mutations in PI3K-p110, PTEN or AKT genes (all frequent molecular features of luminal types of breast tumours) converge in promoting GRK2 accumulation. Enhanced GRK2 levels are also triggered by the amplified oestrogen signalling characteristic of luminal tumours. Increased GRK2 expression, which is detected in transformed breast cell lines, in two murine mammary tumor models and in patients, would in turn activate two key regulatory axis /signalling modules with either Mdm2 or HDAC6 (also up-regulated in luminal breast cancer), leading to promotion of cell proliferation, survival and invasion in transformed cells. We find that ERK1/2-mediated modification of GRK2 at S670 enables GRK2-mediated HDAC6 phosphorylation and stimulation of its tubulin-deacetylase activity and microtubule dynamics, what results in higher persistence growth factor-dependent signalling and increased duration and extent of downstream stimulation of mitogenic and pro-survival molecules such as Ras, MAPK, AKT and Pin1. Moreover, our findings suggest that in breast tumoral contexts, GRK2 can act as a positive modulator of Mdm2 functionality. We describe herein that GRK2 specifically phosphorylates Mdm2 and potentiates the Mdm2-dependent wildtype p53 downmodulation, resulting in enhanced cell survival. On the other hand, the phosphorylation of GRK2 at S670 seems to cause a switch on the sub-cellular distribution of this kinase in tumour cells harboring mutant p53 (as luminal T47D, basal-A MDAMB- 468 or basal MDA-MB-231 cells), what could amplify oncogenic functions by means of the increased functional competence of Ras/Pin1 and HDAC6, which are involved in protecting mutant p53 from degradation and supporting its functionality. In fact, our data show that GRK2 function is required (in a p53 status-independent fashion) for enhanced proliferation, anchorage-independent growth, survival and invasion of tumoral breast cells ¿in vitro¿ and for tumor progression ¿in vivo¿, thus suggesting a relevant and general role for GRK2 as an onco-modulator of key processes involved in breast tumor development El complejo interactoma de GRK2 señala a esta quinasa como un nodo clave para la red de transducción de señales de la célula, participando en procesos básicos tales como la migración celular, la progresión del ciclo celular o la angiogénesis. Tanto los niveles de expresión de GRK2 como su actividad están sometidos a estrictos mecanismos de control que frecuentemente se ven alterados en diversos contextos fisiopatológicos, sugierendo un papel relevante de esta quinasa en la aparición o el desarrollo de estas patologías. En el presente trabajo se ha identificado a GRK2 como un nuevo onco-modulador de la transformación tumoral, responsable de estimular la adquisición de proliferación sostenida, crecimiento independiente de anclaje, supervivencia e invasividad de células de mama. Hemos caracterizado los mecanismos moleculares de la función onco-moduladora de GRK2, demostrando el papel crucial de esta quinasa en la regulación de la ligasa Mdm2 y la deacetilasa HDAC6 y sus consecuencias en la actividad de los módulos celulares de señalización de p53 y de Ras, cuya alteración es clave para la transformación celular. Nuestros resultados indican que la co-regulación al alza de GRK2/Mdm2/ HDCA6 es una nueva característica molecular de los tumores de mama de tipo luminal que podría estar asociada a una mayor agresividad y peor prognosis. Hemos determinado que el exceso de actividad de la cascada de PI3K/Akt, como resultado de mutaciones en PI3K p110, PTEN o AKT o de la amplificación/sobre-estimulación de receptores ErbB, así como la sobre-activación de receptores de estrógenos, convergen en la acumulación de GRK2 en modelos celulares y animales y en pacientes. El aumento de la proteína GRK2 en líneas tumorales de mama luminales, junto con el de su fosforilación por ERK1/2 en el residuo S670 (característica también común a las líneas celulares derivadas de tumores basales) facilita y permite, respectivamente, la modificación por GRK2 de HDAC6, lo que conduce a la estimulación de la actividad tubulina deacetilasa y de la dinámica de microtúbulos, que a su vez lleva a potenciar la duración e intensidad de las señales mitogénicas y de supervivencia, así como a promover un fenotipo migratorio invasivo, estimulando la formación y funcionalidad de invadopodios. Por otro lado, nuestros resultados sugieren un nuevo mecanismo de regulación negativa del supresor tumoral p53 mediada por GRK2 a través del control directo de Mdm2. En contextos oncogénicos de mayor actividad Ras/ ERK1/2 y/o PI3K/Akt, la interacción entre GRK2 y Mdm2 se reprograma con consecuencias funcionales distintas: estabilización de GRK2 y modulación de Mdm2 como nuevo sustrato de GRK2. Hemos identificado los sitios de fosforilación de Mdm2 por GRK2 y demostrado que estas modificaciones aumentan la estabilidad de la ligasa, promueven la interacción de la proteína con p53 causando la desestabilización de p53 y disminuyen las respuestas apoptóticas dependientes de este factor transcripcional. Además, la interrelación de GRK2 con Mdm2 y HDAC6 atenúa la capacidad citotóxica tumoral y anti-proliferativa de compuestos inhibidores de Mdm2 (Nutlin-3a) y de HDAC6 (tubacina, SAHA). Por último, la contribución de GRK2 a las respuestas mitogénicas y de supervivencia a través de la modulación de la actividad de Ras/Pin1 y de p53 vía Mdm2 y HDAC6 es necesaria para el crecimiento y progresión de tumores de mama ¿in vivo¿ tanto basales como luminales, sugiriendo un papel clave y global de GRK2 como onco-modulador de los diferentes procesos que dan lugar al desarrollo del cáncer de mama.