Nuevas aproximaciones de vigilancia de transmisión de Mycobacterium tuberculosis en entornos comunitarios complejos y de otros patógenos relevantes en el entorno nosocomial

Resumen

La aplicación de estrategias de caracterización molecular ha transformado el modo en el que abordamos el conocimiento de las dinámicas de transmisión de microorganismos patógenos. La reciente introducción del análisis genómico ha supuesto una segunda revolución en la capacidad de discriminación entre cepas y en la precisión en la que podemos abordar los estudios epidemiológicos. Sin embargo, son necesarios nuevos esfuerzos para definir el modo más adecuado de integrar las aproximaciones moleculares y genómicas y adaptarlas a diferentes retos epidemiológicos y entornos de análisis. Con este fin, en esta tesis se han definido dos bloques de trabajo, atendiendo a infecciones i) de carácter comunitario, seleccionando a Mycobacterium tuberculosis como patógeno representativo y de alta relevancia global y ii) de naturaleza nosocomial, enfocándonos en Mycobacterium chimaera, como microorganismo responsable del problema emergente derivado de la exposición a dispositivos sanitarios contaminados, y en Pseudomonas aeruginosa MDR, microorganismo de gran relevancia en brotes que implican transmisión personapersona. Cualquier intento de optimizar los sistemas de vigilancia de la transmisión de la tuberculosis (TB) deben enfrentar el nuevo escenario global de la enfermedad, como resultado de los movimientos migratorios internacionales. Siguiendo esta premisa, abordamos la caracterización de la transmisión de TB de alto riesgo, TBmultirresistente, en uno de estos ejes migratorios, el que incluye Latinoamérica y Europa. Nuestra investigación comenzó caracterizando mediante MIRU-VNTR una muestra de cepas MDR circulantes en Lima, Perú, que reveló una elevada tasa de transmisión reciente en esa población. La comparación de esos genotipos con los identificados en cepas circulantes en población migrante de Perú en Europa identificó cepas coincidentes en Italia y España. El análisis genómico determinó con precisión la existencia de dos eventos de exportación intercontinental de TB-MDR desde Perú a Europa, que implicaban a dos variantes de cepas circulantes en Lima, y que una de ellas había sido responsable de una transmisión activa posterior en Florencia. El estudio integrado entre Perú y Europa reveló la necesidad de contar con datos genotípicos de las cepas circulantes de MTB que permitieran abordar estudios transnacionales similares en otros entornos. Lamentablemente, son numerosos los países de origen de migrantes que carecen de sistemas de epidemiología molecular sistemática. De esta necesidad, y tratando de compensar la brecha de conocimiento existente entre los países de origen y destino de migración desarrollamos una estrategia alternativa basada en i) genotipado sistemático por MIRU-VNTR de una muestra de la población a analizar para identificar las cepas más prevalentes, ii) caracterización por secuenciación de genoma completo (WGS) de los clusters prevalentes para identificar SNPs marcadores de cepa y iii) desarrollo de PCRs específicas dirigidas a esas cepas, que optimizaran y simplificaran su vigilancia prospectiva a bajo coste. La estrategia se pilotó en Panamá. El genotipado por MIRU-VNTR de una colección de cepas en dos provincias de Panamá (Panamá y Colón) reveló una alta proporción (50%) de aislados de MTB agrupados en cluster, con una distribución asimétrica de algunas cepas, predominantes, bien en Colón, bien en Panamá. El análisis por WGS de parte de estos clusters permitió evidenciar que únicamente uno de ellos correspondía a eventos de transmisión reciente, con aislados mostrando baja diversidad entre ellos, mientras que el resto correspondían a cepas prevalentes. El diseño de una serie de PCRs especificas permitió asegurar la vigilancia prospectiva in situ de estas cepas, responsables de un tercio del total de casos de TB de las poblaciones estudiadas. Una de las cepas prevalentes en Colón correspondió al linaje Beijing. Debido a que este linaje se ha asociado a una elevada virulencia y transmisión, se realizó una actualización rápida de su presencia en Colón, apoyados en una PCR específica, lo que reveló que es responsable del 57% de los casos incidentes. El estudio integrado de los datos de WGS de todos los aislados identificados, junto con los disponibles en bases de datos globales, permitió determinar que pertenece a un sublinaje Beijing moderno, la rama asiática africana 3 (Bmyc13, L2.2.5), y que su posible entrada a Panamá pudo ocurrir desde Vietnam, como indican los aislados más próximos filogenéticamente. El estudio de la diversidad acumulada por los representantes de esta cepa en Panamá permitió inferir que el período más probable para su entrada en el país fue entre los años 2000 y 2012. Dada la rentabilidad en el estudio de la transmisión de TB de la aplicación de nuestra estrategia combinada de genotipado dirigido, WGS y desarrollo de PCRs específicas de cepas, era oportuno evaluar su transferibilidad al segundo área de interés de esta tesis, las infecciones nosocomiales. Para ello, replicamos el esquema de trabajo desarrollado para TB en la caracterización de un brote por P. aeruginosa XDR, que implicaba a 14 pacientes, que se estaba abordando con genotipado convencional (electroforesis de campos pulsados). El análisis por WGS y la consiguiente PCR específica de cepa dirigida a SNPs marcadores identificados en el estudio genómico, permitió descartar casos no relacionados, e identificar casos nuevos que no habían sido sospechados. Además, definió la existencia de brotes solapantes de menor dimensión, permitió determinar el verdadero caso índice, y finalmente, alertar de que el brote se mantenía aún activo en el momento del análisis. Por último, dentro de nuestro interés de optimizar la vigilancia de transmisión nosocomial, y tras habernos enfocado en la modalidad de transmisión personapersona, era oportuno atender a eventos que implicaban exposición a dispositivos sanitarios contaminados. La reciente alarma global derivada de la exposición de pacientes sometidos a cirugía cardíaca a dispositivos “Heater-cooler” (HCU) contaminados con Mycobacterium chimaera justificó nuestra atención sobre este segundo evento como modelo de estudio. Como respuesta, evaluamos la utilidad de aplicar una PCR en tiempo real para la identificación de M. chimaera, basada en el análisis genómico de sus secuencias específicas, con el fin de dar una doble respuesta para: i) optimizar la vigilancia ambiental prospectiva, directamente sobre las muestras de agua de los dispositivos HCU e ii) identificar retrospectivamente casos infectados por este microorganismo que hubieran pasado desapercibidos. La estrategia mostró su utilidad para la identificación precoz de dispositivos HCU contaminados, permitiendo su monitorización y desveló la infección por M. chimaera en un paciente que había sido sometido a cirugía cardíaca en una institución diferente a la nuestra. El estudio por WGS del aislado del paciente y de los obtenidos de los dispositivos contaminados, permitió demostrar la participación de la cepa responsable del brote global.