Immunomodulatory tetracyclinesFacing the complexity of intestinal inflammation

Resumen

INTRODUCCIÓN La aparición del sistema digestivo es una pieza clave en la aparición de organismos pluricelulares, proporcionando la energía necesaria para evolucionar y adquirir nuevas y más complejas funciones. Para ello, el interior del intestino se moldea para formar una enorme superficie en contacto con millones de bacterias. Desde el inicio, los microorganismos han contribuido a la evolución de este complejo sistema y al desarrollo de sus funciones. Es por ello que el intestino también aloja a la población más potente de células inmunes, que se entrena para diferenciar a potenciales patógenos entre la abundancia de microorganismos comensales[1]. El sistema inmune intestinal cumple con la delicada tarea de mostrar una amplia tolerancia al mismo tiempo que una rápida capacidad de respuesta ante el menor indicio de amenaza[2]. Este equilibrio no sólo se mantiene gracias él, la barrera epitelial y mucosa también juega un importante papel, limitando el acceso de antígenos, al igual que el ecosistema intestinal, que compite con especies potencialmente patógenas, limitando su crecimiento. Estas tres barreras contribuyen al mantenimiento de la homeostasis intestinal, permitiendo al intestino llevar a cabo su función fisiológica. Este equilibrio complejo se ve amenazado por múltiples factores, y cuando el balance se rompe, se desencadena una respuesta inflamatoria con el objetivo de volver a restaurar la homeostasis intestinal[3]. Estos mecanismos desarrollados durante miles de años de evolución, nos protegen de amenazas como parásitos intestinales, infecciones por bacterias patógenas, sustancias tóxicas presentes en los alimentos… Sin embargo, la ausencia de dichas amenazas priva al sistema inmune de dicho entrenamiento, cambios en los estilos de vida y alimentación condicionan la función de la barrera ecológica y la acumulación de alteraciones genéticas que debilitan los mecanismos de barrera, confieren cierta susceptibilidad al desarrollo de inflamación intestinal, incluso en ausencia de una amenaza real. En este contexto, la inflamación se perpetúa, interfiriendo con la función intestinal y causando un daño irreversible al tejido. Es el caso de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)[4], un conjunto de patologías de etiología desconocida que se agrupan en dos grandes categorías, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. En la primera, la inflamación puede aparecer en cualquier zona del intestino, aunque generalmente afecta a colon e íleon, y afecta a las capas más internas de la pared intestinal, causando fístulas, fibrosis y estenosis. En la colitis ulcerosa, el daño se limita a la mucosa, que se extiende de forma continua y ascendente desde el recto. En ambos casos, los episodios de inflamación aparecen de forma repentina, causando diarrea, dolor abdominal y malestar general. Sin embargo, la gravedad de los síntomas puede variar muchísimo, siendo leve en algunos individuos mientras que en otros la inflamación progresa severamente, llegando a requerir la eliminación quirúrgica de zonas afectadas debido a la falta de tratamientos efectivos. El arsenal terapéutico disponible para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal se basaba principalmente en el uso de anti-inflamatorios no esteroideos derivados del ácido salicílico, corticoides e inmunosupresores[4]–[8]. Dado el amplio número de mediadores inflamatorios involucrados, la llegada de terapias biológicas prometía conseguir un mejor control de este proceso patológico; sin embargo, debido a la complejidad de la enfermedad, hasta ahora únicamente los anticuerpos frente a TNFα han mostrado un beneficio claro. Dada la falta de éxito y la creciente incidencia de esta patología, la IBD es un campo de investigación activa en busca de un mayor conocimiento y estrategias terapéuticas que consigan controlar la inflamación intestinal. Entre las diferentes opciones, y dado el importante papel que juega la microbiota en el inicio y desarrollo de la patología, la utilización de antibióticos siempre se ha considerado una posibilidad, aunque no ha mostrado ser realmente útil en todos los grupos de pacientes. Sin embargo, algunos antibióticos han mostrado poseer propiedades adicionales de interés terapéutico, como es el caso de algunos miembros de la familia de las tetraciclinas[9]–[13], objetivo de esta tesis doctoral. OBJETIVOS Esta línea de investigación fue iniciada en el departamento de farmacología de la Universidad de Granada, encontrando que la minociclina ejercía un efecto anti-inflamatorio beneficioso en modelos experimentales de inflamación intestinal. La minociclina es una de las tetraciclinas más estudiadas por sus propiedades adicionales beneficiosas en otras patologías con un cierto componente inflamatorio. En los estudios desarrollados por este grupo, se observó que el efecto beneficioso se debía, en parte, a la presencia de dichas propiedades inmunomoduladoras. Se diseñó a su vez una estrategia terapéutica combinando el tratamiento de la inflamación aguda con minociclina con el mantenimiento de la remisión de los síntomas con la administración del probiótico E. coli Nissle 1917[12]. De esta forma, se consigue controlar el curso recurrente de la enfermedad sin necesidad de prolongar el tratamiento antibiótico, evitando así un impacto excesivo sobre la flora bacteriana. A la vista de estos resultados positivos, el objetivo de esta tesis doctoral consistió en continuar con dicha investigación, comprobando si la actividad anti-inflamatoria intestinal de la minociclina estaba presente también en otros miembros de esta familia de antibióticos e investigando el mecanismo por el cual consiguen dicho efecto, dada la amplia gama de propiedades descritas para estas moléculas. RESULTADOS Para conseguir dicho objetivo general, en primer lugar se comprobó que la doxiciclina también poseía dichas propiedades antiinflamatorias. La doxiciclina mostró una efectividad similar a minociclina al reducir la inflamación inducida por TNBS en rata y por DSS en ratón. Entre los mecanismos puede estar implicada su capacidad para disminuir la producción de mediadores inflamatorios, como IL-8 observado directamente en células epiteliales, o la producción de radicales libres y oxidantes, comprobado mediante su actividad in vitro disminuyendo la producción de nitritos en macrófagos. Este efecto se ve reflejado in vivo, reduciendo la expresión de citoquinas inflamatorias y los niveles de MPO y glutatión, indicativo de un menor daño oxidativo y menor daño a la barrera epitelial. Al igual que con minociclina, la asociación de doxiciclina junto con un probiótico, en este caso S.boulardii, consigue disminuir el episodio agudo de inflamación y mantener posteriormente la remisión, reduciendo el impacto inflamatorio sobre el tejido y haciéndolo menos susceptible al desarrollo de un nuevo brote. Comprobada la actividad antiinflamatoria de doxiciclina y minociclina, quisimos profundizar en los posibles mecanismos responsables del efecto beneficioso de estos fármacos. Para ello se llevaron a cabo dos estudios en modelos experimentales de colitis similares a los utilizados anteriormente, el DSS y el DNBS, ambos en ratón. En estos nuevos estudios se incluyeron, además de doxiciclina y minociclina, un fármaco antibiótico de acción local (rifaximina), la tetraciclina, que carece de propiedades inmunomoduladoras tan marcadas, una tetraciclina de tercera generación, derivada de minociclina, y un corticoide (dexametasona), con propiedades inmunomoduladoras, pero sin efecto antibiótico. El efecto de los diferentes tratamientos se evaluó de forma general, sobre la evolución del proceso colítico, a nivel histológico y de expresión génica de varios marcadores de la función barrera, mediadores inflamatorios, receptores TLR y microRNAs, involucrados en la regulación de múltiples vías celulares y cuya modulación puede tener un importante efecto sobre la respuesta inflamatoria. Adicionalmente, se evaluaron los cambios en la composición de la microbiota por pirosecuenciación. Los resultados obtenidos mostraron un claro beneficio terapéutico en ambos modelos en los grupos tratados con las tetraciclinas inmunomoduladoras, doxiciclina, minociclina y tigeciclina, mientras que la tetracilina y el resto de tratamientos no siempre consiguió modificar el curso de la inflamación. En el modelo del DNBS, agresivo y con una alta mortalidad, las tetraciclinas inmunomoduladoras consiguieron aumentar la supervivencia y disminuir la pérdida de peso, el acortamiento colónico y el intenso daño histológico al tejido. La dexametasona no mostró ningún efecto terapéutico y los otros dos antibióticos, especialmente la tetraciclina, mejoraron ligeramente la pérdida de peso hacia al final del ensayo, tras 6 días de tratamiento. Esto se vio reflejado en una mejora general del perfil de expresión génica de este modelo, mejorando la protección de la barrera mucosa y disminuyendo varios mediadores inflamatorios. Cabe destacar el incremento que todas las tetraciclinas inducen en la expresión de Ccl2, quimiocina involucrada en el reclutamiento de macrófagos, que se encuentra disminuida en este modelo. Ninguno de los TLRs se modificó significativamente en la colitis inducida por DNBS, aunque destaca el incremento consistente inducido por las tetraciclinas inmunomoduladoras sobre la expresión de TLR6. Las alteraciones en la expresión de microRNAs son sutiles, modificándose principalmente los miR-146a, 155 y 223 en el grupo control colítico, aunque los efectos de los tratamientos no alcanzaron significancia estadística en la mayoría de los casos. La evaluación de la composición de la microbiota mostró diferencias significativas entre sanos y enfermos, y especialmente en los grupos tratados con antibióticos, indicativo una vez más de que el efecto antibiótico debe jugar un papel importante en este modelo de inflamación intestinal. Sin embargo, como muestran los marcadores inflamatorios evaluados y la propia evolución de los animales, dicho efecto aislado no es suficiente y únicamente consigue controlar la inflamación cuando se refuerza con el efecto inmunomodulador de doxiciclina, minociclina y tigeciclina. En el modelo del DSS, se llevaron a cabo dos ensayos, uno más agresivo y prolongado, en el que se vio el efecto de los tratamientos sobre la evolución y mortalidad, y otro más controlado, sacrificando tras cuatro días de tratamiento, suficientes para que las tetraciclinas inmunomoduladoras obtuvieran un efecto significativo. En el primer ensayo, de 6 días de tratamiento, al igual que en el DNBS, se produjo una alta mortalidad, que solamente fue reducida por doxiciclina, minociclina y tigeciclina, mientras que el efecto de la tetraciclina fue muy limitado, y la dexametasona y rifaximina no consiguieron un impacto beneficioso, siendo la última incluso perjudicial. Estos efectos se mantuvieron en el segundo ensayo, observando una mejora del índice de actividad de la enfermedad desde el primer día de tratamiento con los antibióticos inmunomoduladores que se reflejó a su vez en un daño histológico significativamente menor. La evaluación de marcadores de la barrera mostró una clara mejora de la producción de mucus y proteínas de unión intercelular, y parámetros inflamatorios como la producción de IL-6, IL-1β y la quimiocina atrayente de neutrófilos también fueron reducidas significativamente. Sin embargo, al igual que en el modelo del DNBS, las tetraciclinas inmunomoduladoras produjeron un fuerte incremento de Ccl2, que ya se encontraba incrementada en el grupo control de ratones colíticos, sugiriendo un incremento en el reclutamiento de monocitos y células dendríticas al foco inflamatorio. Dicho efecto paradójico también se observó en la expresión del miR-142, que siguió el mismo patrón, siendo incrementado en el modelo de inflamación pero más aún con las tetraciclinas inmunomoduladoras. Las variaciones en la expresión de otros microRNAs destacan principalmente el incremento de miR-150, 155 y 223, cuya expresión se vio disminuida por los fármacos con efecto inmunomodulador. Por último, cabe destacar la disminución de TLR4 en la colitis inducida por DSS, un efecto que fue contrarrestado en los grupos tratados con doxiciclina, minociclina y tigeciclina, consistente con su efecto positivo y, probablemente, ligado a una mejor reconstitución de la barrera epitelial. No se observaron modificaciones significativas de la composición de la microbiota, ni en el modelo ni con los tratamientos, lo cual apoya la ausencia de beneficio del efecto antibiótico en este modelo, aunque también pueda deberse a la menor duración del tratamiento. Ya que la importancia real de la microbiota radica en su funcionalidad y que el impacto de los antibióticos puede resultar negativo, quisimos descartar la presencia de cambios que no fueran apreciados en la evaluación de la composición a nivel filogenético. Para ello utilizamos un modelo de transferencia fecal, con el que consiguiéramos implantar la microbiota resultante tras el proceso colítico inducido por DSS y el tratamiento farmacológico en ratones a los que previamente se había reducido su microbiota original mediante el tratamiento prolongado con un coctel antibiótico. Se transfirió la microbiota de ratones sanos, colíticos y colíticos tratados con minociclina, y se procedió a evaluar la susceptibilidad a una inflamación inducida por DSS. Inesperadamente, se observaron diferencias en la evolución de los animales: el grupo transferido con microbiota de ratones colíticos no tratados resultó más sensible a la inflamación por DSS que el grupo control al que no se realizó transferencia y que los ratones transferidos con microbiota de ratones sanos y de ratones colíticos tratados con minociclina. Este efecto se evidenció también a nivel histológico y al evaluar algunos marcadores de la función barrera, aunque los cambios en estos fueron muy sutiles y no se detectaron variaciones en la activación de citoquinas del sistema inmune. Por tanto, estos resultados indican que, aunque moderados, los efectos de la inflamación inducida por DSS sobre la microbiota pueden predisponer a nuevos brotes inflamatorios y que el efecto antibiótico de un tratamiento con minociclina, lejos de empeorar esta situación, consigue revertirla a niveles basales. A la vista de estos datos, nos resultó especialmente interesante el incremento de Ccl2, que indicaría un aumento de la población de macrófagos, y su papel en la respuesta inflamatoria. Por ello evaluamos el efecto in vitro de estos tratamientos sobre el cultivo primario de macrófagos derivados de médula ósea estimulados con LPS. Observado que el efecto inmunomodulador se asociaba con una disminución de la expresión de iNOS, marcador del fenotipo de activación M1, aunque tan solo la dexametasona conseguía disminuir la producción de citoquinas inflamatorias, como TNFα, IL-1β e IL-6. Es más, su producción se veía fuertemente incrementada por el efecto de las tetraciclinas inmunomoduladoras, tanto a nivel basal como tras la estimulación con LPS, indicando la presencia de un efecto divergente sobre diferentes vías de activación, un resultado que también ha sido observado por otros grupos de investigación. Aparentemente, este resultado podría ser contradictorio con el efecto anti-inflamatorio observado hasta ahora, pero dado el importante papel que llevan a cabo los macrófagos en el control del proceso inflamatorio, y en concreto en el modelo de inflamación inducido por DSS, nos propusimos profundizar en esta línea para determinar, si el mecanismo de acción de las tetraciclinas con propiedades inmunomoduladoras, pueda estar mediado por una potenciación de la función protectora de los macrófagos sobre otras que perpetúan la inflamación. Utilizando el modelo del DSS y el tratamiento con minociclina, ya que es el fármaco más estudiado por sus efectos inmunomoduladores, evaluamos los cambios en las principales poblaciones inmunes mediante citometría de flujo. Tras cuatro días de tratamiento, comprobamos que efectivamente se produjo un incremento en las poblaciones de macrófagos y células dendríticas, cuyos precursores son atraídos al intestino inflamado por el incremento de Ccl2[14]. De hecho, únicamente se observó una disminución en la infiltración por neutrófilos, cuya respuesta proteolítica y oxidativa es responsable en gran medida del daño causado en el tejido inflamado. No se observaron cambios en la población de células B, la más numerosa, mientras que el tratamiento con minociclina potenció ligeramente el incremento de células T y produjo un aumento del número de eosinófilos, no existiendo diferencias entre sanos y tratados en esta población. El análisis en más profundidad reflejó cómo la minociclina, a pesar del incrementar el número de macrófagos, estos no se acumulan con el fenotipo inflamatorio que perpetúa el proceso, sino que maduraron al fenotipo de macrófagos residentes, cuyo papel en la regeneración y resolución del proceso inflamatorio puede mediar el efecto beneficioso observado a nivel global. El perfil de las poblaciones de células dendríticas no se vio alterado por el tratamiento con minociclina. El análisis de las diferentes subpoblaciones de células T colaboradoras, incrementadas en el grupo tratado, mostró una mayor abundancia de células T reguladoras y Th17, las principales implicadas en este modelo, así como de células Th2, lo cual puede estar relacionado la mayor presencia de eosinófilos y macrófagos residentes, potenciando respuesta inmune local tipo 2, asociada a la regeneración y protección de mucosas. Dicho perfil también se observó en nódulos mesentéricos, donde si inicia la respuesta inmune adaptativa, y en bazo y sangre, representativos de la respuesta sistémica, observando una intensa neutrofilia en el grupo control, que fue contrarrestada por el tratamiento. La evaluación de la expresión génica confirmó el incremento de IL-4 e IL-22, que podrían explicar los cambios observados y el efecto beneficioso sobre la protección de la barrera epitelial y mucosa, así como el incremento de la enzima implicada en la síntesis de mediadores lipídicos involucrados en la resolución del proceso inflamatorio. Por último, dicho análisis se repitió tras dos días de tratamiento, con el objetivo de capturar los eventos iniciales desencadenados por la minociclina. Aquí no se observaron cambios en las poblaciones inmunes presentes en el intestino, aunque sí destacó un fuerte efecto sistémico, incrementando las poblaciones de la línea mieloide, neutrófilos, eosinófilos y monocitos, acelerando el perfil de inflamación observado en el grupo control a día 4. La evaluación de la expresión génica en el tejido colónico sí reveló importantes cambios. Se observó el aumento de Ccl2 y Ccl11, que explicarían la mayor presencia de macrófagos y eosinófilos observados a día cuatro, así como una potenciación de la expresión de las citoquinas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-4, GM-CSF e IL-22. Las dos primeras coinciden con el efecto directo observado in vitro de la minociclina sobre macrófagos, potenciando estas vías inflamatorias. El aumento de IL-10 e IL-4 están implicados en la potenciación de la respuesta mediada por células T reguladoras y Th2. Por último, GM-CSF e IL-22 son producidos por las células linfoides innatas tipo 3 (ILC3), una población recientemente descubierta y actualmente el foco de una intensa investigación, dado su papel en la respuesta inmune asociada a mucosas. Dada la amplia gama de propiedades y acciones de las tetraciclinas inmunomoduladoras en múltiples poblaciones celulares, sería difícil y definir su efecto anti-inflamatorio intestinal mediante un único mecanismo. Su capacidad antioxidante, la regulación de procesos apoptóticos y la proliferación celular, la inhibición de enzimas implicadas en el proceso inflamatorio, como metaloproteinasas que digieren la matriz extracelular, y la modificación de la liberación de citoquinas y otros mediadores en células epiteliales, estromales e inmunes, todas ellas, contribuyen al gran efecto beneficioso observado. Pero además, el controvertido efecto pro-inflamatorio observado en macrófagos puede a su vez contribuir, y en gran medida, al control de la inflamación intestinal. La activación temprana de la respuesta inflamatoria mediada por macrófagos parece potenciar y acelerar la respuesta inflamatoria, influyendo sobre las ILC3 y mejorando la protección de la barrera epitelial mucosa. Esto contribuye a frenar rápidamente el paso de bacterias y antígenos que perpetúan la inflamación. A su vez, este efecto pro-inflamatorio cambia rápidamente hacia una respuesta alternativa tipo 2 y pro-resolutiva, mediada por el incremento de macrófagos residente, células T reguladoras y eosinófilos y Th2, que limita la llegada de neutrófilos, el daño al tejido y contribuye a la protección y regeneración de la barrera mucosa. El incremento observado en células Th17 puede ser consecuencia de esa potenciación inicial de la respuesta inmune, pero dado su papel dual en la protección de mucosas y el hecho de que este sea un modelo de inflamación aguda no desencadenada por una alteración inmune, sino por el daño a la mucosa, tampoco debería descartarse un efecto beneficioso del papel de esta población, con capacidad de producir IL-22 y el consiguiente efecto beneficioso sobre la barrera epitelial. CONCLUSIÓN En conclusión, los resultados obtenidos hasta ahora apoyan fuertemente el potencial de las tetraciclinas inmunomoduladoras en el control de la inflamación aguda, pudiendo resultar muy beneficiosas para limitar el daño tisular generado por los brotes de inflamación por los que se caracteriza la IBD. De hecho, los estudios genéticos muestran que las principales alteraciones encontradas se centran en defectos de la inmunidad innata y la capacidad de proteger la homeostasis intestinal, más que en alteraciones que potencien directamente la respuesta inflamatoria. Esto explica en gran medida el fracaso obtenido con fármacos que atacan la respuesta inmune, anti-inflamatorios y terapias biológicas, cuyo objetivo es controlar las consecuencias de la enfermedad, una vez que la inflamación y el daño han sido generados. A pesar de la utilidad de estos grupos farmacológicos, un mayor control inicial de los brotes y el mantenimiento de los periodos de remisión se podría conseguir con estrategias como la que proponemos, combinando el uso de tetraciclinas inmunomoduladoras, que rápidamente induzcan remisión, y probióticos, que mejoren y protejan la homeostasis intestinal sin atacar agresivamente al sistema inmune y los mecanismos de protección naturales, desarrollados durante miles de años de evolución. BIBLIOGRAFÍA [1] M. Faderl, M. Noti, N. Corazza, and C. Mueller, “Keeping bugs in check: The mucus layer as a critical component in maintaining intestinal homeostasis,” IUBMB Life, vol. 67, no. 4, pp. 275–285, Apr. 2015. [2] A. M. Mowat and W. W. Agace, “Regional specialization within the intestinal immune system,” Nat. Rev. Immunol., vol. 14, no. 10, pp. 667–685, Oct. 2014. [3] K. J. Maloy and F. 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