Estudio de la expresión del gen CD200R en células epiteliales de intestinoregulación transcripcional por anoikis

Resumen

La proteína CD200R es receptor para la proteína CD200, y es expresada por timocitos, células dendríticas foliculares, endotelio vascular, células B recirculantes, células T activadas y neuronas tanto del sistema nervioso central como periférico. Muchos estudios sugieren que la señalización producida por la interacción CD200-CD200R disminuye la actividad de las células mieloides. Se ha comprobado que la interacción de CD200R con CD200 provoca una señal inmunosupresora que inhibe la actividad de los macrófagos, induce de células T reguladoras, cambia el perfil de citoquinas desde Th1 a Th2 e inhibe de la inmunidad específica de tumor de las células T. Al comienzo de este trabajo se sabía que la expresión del gen CD200R1 sólo había sido descrita en células de la línea mieloide; no obstante, nuestro grupo de investigación había caracterizado el gen CD200R humano y comprobado que se expresaba también en células epiteliales de intestino y asociada a su diferenciación celular sobre la matriz de proteínas extracelulares Matrigel. El objetivo del presente trabajo consistió en conocer los mecanismos de regulación de la expresión del gen CD200R1 en células epiteliales de intestino. Los objetivos del trabajo de investigación fueron los siguientes: 1. Determinar la expresión del gen a lo largo del eje longitudinal durante la maduración posparto del epitelio intestinal así como su localización celular. 2. Identificar el/los componente/s del Matrigel como inductores de la expresión del gen Cd200r1. 3. Alternativamente, identificar procesos celulares asociados a la fisiología de la célula epitelial como posibles reguladores de la expresión de CD200R1. 4. Identificar el promotor de CD200R1 para realizar estudios de regulación transcripcional. 5. Estudiar del papel regulador de la anoikis en la expresión del gen CD200R1. 6. Comprobar la inducción en la expresión del gen CD200R1 en células epiteliales aisladas de intestino de rata. 7. Analizar la expresión de los genes CD200 y CD200R en biopsias de enfermos de colitis ulcerosa y de Crohn. Los resultados previos de nuestro grupo habían determinado que el gen Cd200r1 era expresado por los enterocitos y que su expresión disminuía cuando las células eran diferenciadas sobre la matriz extracelular Matrigel. Para conocer la localización del receptor se realizó un estudio para detectar la proteína CD200R tanto a nivel celular como tisular. Así, mientras a nivel celular, la expresión de dicha proteína fue tan baja que no reveló ningún dato significativo pues aparecía en distintas zonas de la célula, a nivel tisular se observó un patrón diferencial de la expresión a lo largo del eje longitudinal intestinal y según el tiempo de desarrollo. CD200R se expresa en todo el eje intestinal desde el nacimiento hasta el destete, momento en el cual queda restringido al colon. En paralelo, se procedió a analizar si algún componente de la matriz extracelular empleada (Matrigel) pudiera regular la expresión de Cd200r1. No se obtuvieron resultados concluyentes, ni en cada componente por separado ni mezclando todos los componentes. Puesto que ningún componente de la matriz era responsable claro de la disminución en la expresión de Cd200r1, el estudio continuó analizando qué posibles procesos biológicos asociados a la fisiología de las células epiteliales de intestino podían intervenir en la regulación de la expresión de Cd200r1. Nos planteamos cuatro procesos biológicos: diferenciación inducida por confluencia celular, inflamación, estrés oxidativo y anoikis (apoptosis por pérdida de anclaje). El análisis del primero de ellos aportó resultados aparentemente contradictorios, pues en este caso la expresión de Cd200r1 aumentaba mientras que en la diferenciación sobre la matriz extracelular, Matrigel, disminuía. Otros procesos, como el estímulo proinflamatorio con LPS y el estrés oxidativo que causa daño celular, mostraron variaciones en la expresión de Cd200r1, si bien no fue posible relacionarlas con suficiente fiabilidad y reproducibilidad, al no encontrar correlación entre las concentraciones utilizadas y los resultados obtenidos. Paralelamente, se identificó y clonó el promotor de CD200R en el vector de expresión p-DSRed-Express-1. El siguiente objetivo se centró en estudiar si la apoptosis o anoikis podían regular la expresión de CD200R1. Para generar apoptosis se procedió a la utilización de dos métodos: la adición de butirato al medio de cultivo y la suspensión celular. Se comprobó que la anoikis era la causa del incremento en la expresión de CD200R1 y que esta expresión era controlada por la ruta apoptótica dependiente de caspasas. Para confirmar que la regulación de la expresión del gen CD200R1 se debía a la anoikis, se analizó el control por contacto con la cadena Beta1 de la integrinas sobre las células en suspensión y se utilizó un inhibidor de la PI3K, un enzima clave en la señalización intracelular desde las integrinas. Los resultados mostraron que, efectivamente, CD200R1 está regulado por la anoikis a través de esta ruta. La inserción del promotor de CD200R1 en el vector de expresión permitió transfectar células que posteriormente fueron sometidas a anoikis. El análisis de dichas células confirmó que la regulación de este gen es de tipo transcripcional ya que las células en suspensión emitían fluorescencia. El estudio continuó analizando si este proceso también ocurría en células epiteliales de rata. Para ello, se extrajeron enterocitos de intestino de rata que fueron sometidos a anoikis. Los experimentos revelaron que, igual que en las líneas celulares, fisiológicamente la anoikis regula la expresión de CD200R. Para completar el estudio, se procedió a comprobar si CD200R se expresaba asociado a la apoptosis de otros tipos celulares, concretamente células MCF-7 y MG-63. Los experimentos demostraron que dichos tipos celulares también expresaban CD200R, aunque posiblemente controladas por apoptosis independiente de caspasas. La memoria de tesis doctoral concluye con el análisis de CD200 y de las isoformas de CD200R1 en biopsias de enfermos de Crohn y de colitis ulcerosa. Hemos comprobado que existen diferencias en el patrón de expresión de CD200R entre ambas enfermedades según la isoforma analizada.