Stimuli-responsive systems based on elastin-like recombinamers for biomedical applications

Resumen

Los desafíos a los que se enfrenta el campo de los biomateriales se han intensificado en la última década. Las investigaciones actuales en el diseño de nuevos materiales "inteligentes" se han dirigido a la búsqueda de materiales que imiten los tejidos biológicos y su funcionalidad celular a través de la experimentación con sistemas nanoestructurados. La nanobiotecnología ofrece la posibilidad de producir superficies con texturas y materiales en la nanoescala capaces de simular entornos naturales. Como ejemplo, la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa requieren biomateriales que promuevan respuestas celulares específicas influyendo en la adhesión, el crecimiento y la organización celular. Por lo tanto, un considerable esfuerzo se ha centrado en el desarrollo de nuevos materiales y técnicas de fabricación para generar nuevos sustratos que presenten algunas de las características químicas, físicas y biológicas más importantes de la matriz extracelular (ECM). Las técnicas de ingeniería genética ofrecen una ruta sencilla para diseñar y biosintetizar polímeros basados en proteínas que pueden incorporar dominios estructurales y funcionales para la construcción de una ECM artificial. Los recombinámeros de tipo elastina (ELRs) se basan en la repetición de ciertos pentapéptidos que están presentes en la elastina natural y que se pueden producir con un extraordinario grado de complejidad y control. Están formados por secuencias pentapeptídicas repetidas de aminoácidos VPGXG (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly), donde Xaa es cualquier aminoácido natural excepto L-prolina. Esta familia presenta un amplio conjunto de propiedades interesantes: extraordinaria biocompatibilidad, excelentes propiedades mecánicas, respuesta a estímulos y capacidad de autoensamblaje. Los ELRs experimentan una transición de fase en respuesta a cambios en la temperatura en soluciones acuosas denominado proceso de Transición Inversa con la Temperatura (ITT). Las cadenas de polímero son solubles en agua, sin embargo, por encima de la temperatura de transición (Tt) las cadenas forman nano-y microagregados que segregan de la disolución. Su biocompatibilidad y sus adecuadas propiedades mecánicas los convierten en buenos candidatos para incorporar péptidos cortos que tienen bioactividades específicas, como adhesión celular REDV (Arg-Glu-Asp-Val), específico para las células endoteliales, o la secuencia general de adhesión RGD (Arg-Gly-Asp) así como dominios de entrecruzamiento VPGKG (Val-Pro-Gly-Lys-Gly) que contienen E-amino grupos y otros. Los ELRs son una clase de materiales proteicos que exhiben ciertas propiedades que los hacen adecuados para algunas de las aplicaciones utilizadas en ciencia de polímeros, tal como el uso de copolímeros de bloque con características adaptadas para nano (bio) aplicaciones tecnológicas. Los co-recombinámeros en bloque anfifílicos de elastina (ELbcRs) comprenden bloques bien definidos de monómeros composicionalmente distintos que tienen polaridades y afinidades de interacción en disoluciones acuosas significativamente diferentes, los cuales son imposibles de obtener con técnicas químicas convencionales. La transición de fase en respuesta a cambios en la temperatura puede ser modulada convenientemente a través de la manipulación de la arquitectura macromolecular, es decir, la longitud, la composición y la secuencia de los bloques individuales. La identidad y la secuencia de las unidades de bloque individuales dentro del polímero determina la naturaleza de la estructura supramolecular. El trabajo compilado aquí es parte de un proyecto a largo plazo centrado en el desarrollo de nuevos biomateriales que demuestran la creciente funcionalidad en diversas aplicaciones biomédicas y que van desde los hidrogeles bioactivos a las nanopartículas con el objetivo de abrir su prometedor campo de aplicaciones biómedicas. Una introducción general se presenta en el capítulo 1, mostrando una extensa revisión bibliográfica sobre la versatilidad de los ELRs. El primer objetivo de esta tesis ha sido obtener hidrogeles multifuncionales de ELRs obtenidos por entrecruzamiento químico con hexametilendiisocianato (HDI), un entrecruzante orientado a lisinas, con bioactividad (incorporando diferentes péptidos de adhesión celular, RGD o REDV) adecuadas propiedades mecánicas y topografía controlada. Los hidrogeles son uno de los materiales más prometedores y versátiles ya que presentan enormes posibilidades y potencialidades en el campo de las ciencias biomédicas. Entre los materiales utilizados para aplicaciones regenerativas, los hidrogeles están recibiendo cada vez más atención debido a su capacidad para atrapar grandes cantidades de agua, por su buena biocompatibilidad y su capacidad de imitar el entorno. Curiosamente, los hidrogeles basados en ELRs conservan las características termo-sensibles de la familia ELR y una clara Tt puede ser estudiada en hidrogeles entrecruzados por técnicas calorimétricas. A partir de este objetivo, se establecieron dos líneas de investigación: hidrogeles con topografías microestructuradas e hidrogeles porosos. La línea de investigación presentada en el capítulo 2 fue la combinación de métodos de litografía suave (moldeo por réplica) con hidrogeles bioactivos, para obtener hidrogeles químicamente entrecruzados con patrones seleccionados de diferentes tamaños y características. Estos hidrogeles bioactivos mostraron un comportamiento termosensible en medios acuosos proporcionando sustratos funcionales para estudiar el comportamiento celular e imitar sistemas biológicos para ingeniería de tejidos. Varios estudios se están llevando a cabo para investigar la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular en estos andamios. La segunda línea de investigación se presenta en el capítulo 3 y consiste en la obtención de hidrogeles porosos para que las células trasplantadas puedan crecer y generar su propia matriz extracelular. En estos hidrogeles se requiere una porosidad elevada, un control de tamaño de poro adecuado, y la interconectividad entre los poros también es esencial para la vascularización y la difusión de nutrientes. Este estudio se ha desarrollado mediante técnicas que incorporan sales efervescentes durante el entrecruzamiento. Los resultados mostraron claras diferencias en las propiedades físicas de los hidrogeles con la variación de la relación en peso de sal / ELR y la temperatura ambiental. La distribución de tamaño de poro medio se puede controlar por el tamaño de las partículas de sal. El proceso de salida del gas, por inmersión en una solución de ácido cítrico después del entrecruzamiento, facilitó la interconectividad y la obtención de una superficie estriada, que es importante para permitir la colonización de las células. Los ensayos de viabilidad celular in vitro con células endoteliales mostraron el éxito de los dos objetivos principales generales para su futura aplicación en ingeniería de tejidos: primero confirmar la biocompatibilidad de los hidrogeles y en segundo lugar confirmar que la estructura porosa era adecuada para la infiltración de células a través de su superficie permitiendo la subsiguiente colonización celular. El segundo objetivo de esta tesis fue estudiar el auto-ensamblaje de los ELbcRs anfifílicos para el desarrollo de nuevas nanoplataformas y geles. La necesidad creciente de sistemas biocompatibles de liberación de fármacos que mejoren la actividad y la especificidad ha conducido al mismo tiempo al desarrollo de una amplia variedad de nuevos materiales. La mayor parte de este esfuerzo se ha desarrollado en sistemas poliméricos debido a su capacidad para formar una variedad de estructuras diferentes de nanopartículas, incluyendo micelas, nanoesferas, nanocápsulas o polimersomas. Este trabajo se presenta en el capítulo 4, donde se muestra el autoensamblaje de diversos di- and tri- ELbcRs anfifílicos mediado por la temperatura en disoluciones neutras acuosas. El control en el peso molecular y la proporción de los bloques hidrófilo /hidrófobo junto con la disposición y la longitud del bloque hidrofílico proporcionan diferentes nano-objetos como micelas o vesículas con varios tamaños. El potencial de los ELbcRs que se autoensamblan en respuesta a estímulos ambientales como el pH o la temperatura los hace muy atractivos para la construcción de nano-dispositivos avanzados. El posterior diseño y desarrollo de un tetrabloque ELbcR anfifílico mostrado en la última parte de este trabajo, capítulo 5, ha permitido la obtención de un gel inyectable reversible por acción de la temperatura en condiciones suaves y fisiológicas. Una limitación importante de la mayoría de los materiales utilizados como soportes en ingeniería de tejidos es la necesidad de su implantación quirúrgica. Para muchos usos clínicos, se prefieren los hidrogeles inyectables porque se pueden formar en el sitio de la lesión y se adhieren al tejido durante la formación de gel minimizando la invasividad del procedimiento. Además, se pueden incorporar diversos agentes terapéuticos (por ejemplo, factores de crecimiento) y encapsular células, entre otros. En este sentido, hemos obtenido hidrogeles autoensamblados con patrones seleccionados combinando las técnicas de litografía suave. Esta perspectiva podría ser utilizada para estudiar el comportamiento de células en las superficies microestructuradas con la posibilidad de ajustar las propiedades mecánicas durante el cultivo celular variando la temperatura o también podría ser explotado en estrategias combinadas de, por ejemplo, recolección de células, en el que, una vez que las células han crecido sobre el sustrato, se pueden recoger simplemente enfriando el sistema por debajo de la temperatura de gelificación. En cuanto a la aplicación como gel inyectable, la incorporación de secuencias bioactivas ha permitido su uso en diferentes estudios para investigar la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular que han demostrado el excelente potencial de esta nueva familia de ELRs para regeneración de tejidos. En general, el trabajo desarrollado a lo largo de esta tesis pretende contribuir a la evolución de las nuevas aplicaciones de ELRs al campo de los biomateriales, y algunos de ellos se resumen en el capítulo 6, como perspectivas de futuro.