Biofunctional hydrogels based on elastin-like recombinamers as extracellular matrix analogues

Resumen

INTRODUCCION Actualmente, uno de los objetivos de los investigadores en el área de la ingeniería de tejidos consiste en la obtención de biomateriales reabsorbibles o biomateriales que no sean reconocidos por nuestro organismo como algo exógeno y en consecuencia pudiera producir una reacción de rechazo; y que induzcan una completa regeneración de la zona dañada. Esos materiales deben actuar como andamios que tienen que cumplir principalmente tres requisitos: el primero es facilitar la distribución y colocación de células en el sitio preciso donde son requeridas, el segundo es que deben constituir un espacio tridimensional, con la estructura y propiedades mecánicas apropiadas para la formación del nuevo tejido de sustitución. Y el tercer y último requisito, pero no por ello menos importante, es que esos materiales deben servir de guía para el desarrollo del tejido regenerado y que este pueda cumplir con la función apropiada de una forma normal, sin que el resto de los tejidos se vean afectados y por tanto la vida del paciente. Como es evidente a simple vista, este es un objetivo muy ambicioso, pues lo que se pretende es imitar a la matriz extracelular (ECM de sus siglas en inglés ¿extracellular matrix-), que tan bien ha sido diseñada por la naturaleza a lo largo de miles de años de evolución. MEMORIA La necesidad de nuevos biomateriales que imiten, potencien o sustituyan a los materiales naturales es cada vez mayor a medida que las ciencias médicas evolucionan. Por ello es clave el desarrollo de nuevos sistemas biocompatibles que puedan cubrir estas necesidades. En esta tesis se ha trabajado en el desarrollo de nuevos biomateriales basados en recombinámeros tipo elastina (ELRs de sus siglas en inglés Elastin-Like Recombinamers) (1). Estos ELRs han sido modificados mediante técnicas químicas, lo que ha permitido introducir funcionalidades adecuadas para obtener un entrecruzamiento covalente entre ellos mediante una reacción de tipo ¿click¿ (2, 3). También se han combinado con otros biomateriales naturales como el fibrinógeno para formar sistemas híbridos de ELRs-fibrina (ELR-FGs) (6) con el fin de mejorar las propiedades mecánicas e introducir biofuncionalidades controladas en los geles de fibrina, ampliamente empleados en ingeniería de tejidos hasta ahora (7). Como primer paso se abordó la formación de hidrogeles macroscópicos que imiten la matriz extracelular y que sean totalmente biocompatibles ya durante el proceso de manufactura; permitiéndonos obtener un sistema con las propiedades mecánicas y biológicas apropiadas para una colonización total por parte de las células y que puedan ser utilizados en procesos de regeneración tisular. Para ello se han abordado dos estrategias distintas, una consistente en la formación de hidrogeles formados solo por ELRs, y otra en la que estos ELRs forman parte de un gel hibrido en el que el otro componente es el fibrinógeno. En la primera estrategia se modificaron los ELRs mediante reacciones químicas de amidación, de forma que portasen grupos funcionales que reaccionasen, en condiciones fisiológicas, con otros ELRs modificados para formar redes (hidrogeles) mediante la metodología ¿CLICK¿ con catalizador primeramente, y posteriormente se evolucionó a un sistema sin ningún tipo de catalizador que pueda afectar al normal desarrollo y crecimiento de las células. De esta forma se obtuvieron geles de ELRs mediante química click sin catalizador (ELRs-CFCGs (4). Para la segunda estrategia se diseñaron ELRs con un alto contenido en el aminoácido lisina para promover la reacción entre los grupos amino de las lisinas y los carbonilos de las glutaminas presentes en el fibrinógeno mediante la presencia del factor XIIIa de la transglutaminasa. Así se han obtenido geles híbridos de ELRs y fibrina (ELRs-FGs) (6). De esta forma se han obtenido hidrogeles tanto ELR-CFCGs como ELR-FGs de distinta composición y concentración que nos proporcionan las propiedades biológicas y mecánicas adecuadas para la regeneración de distintos tipos de tejidos (tejido óseo, pericardio, cartílago, válvulas cardíacas, epidermis¿). Estos hidrogeles se han aplicado en ingeniería de tejidos. En concreto, como primera aplicación, los ELRs-CFCGs se han aplicado en el recubrimiento de stents metálicos para tratar problemas de estenosis de los vasos sanguíneos y tratar de evitar los problemas de reestenosis que existen en la actualidad con los stents metálicos tradicionales (BMS) o con los nuevos ¿Drug eluting stents¿ (DES). El objetivo de estos sistemas de stent recubiertos por geles de ELRs es conseguir una buena integración en el sistema circulatorio, promover una completa endotelización del dispositivo y por consiguiente eliminar o disminuir los problemas de rechazo y/o reestenosis que se pudieran producir. Estos sistemas se han testado mecánicamente y se ha probado su citocompatibilidad in vitro (9) obteniendo unos resultados muy prometedores que se testarán in vivo. Una segunda aplicación dentro del campo de la ingeniería de tejido tanto de los ELR-CFCGs como de los ELR-FGs fue formar válvulas aórticas. Actualmente las técnicas empleadas para la sustitución de este tipo de válvulas incluyen el uso de válvulas metálicas o plásticas, el uso de válvulas naturales descelularizadas o el uso de válvulas moldeadas con biomateriales. Pero de momento todas ellas tienen ciertas carencias que han de ser mejoradas. En esta tesis se han construido válvulas aórticas con ELR-CFCGs y ELR-FGs, han sido testadas mecánicamente in vitro y se han hecho análisis histológicos del tejido obtenido tras 21 días de cultivo in vitro y en condiciones dinámicas en un bioreactor especialmente diseñado para ello obteniendo excelentes resultados tanto mecánicos, como funcionales e histológicos. En una segunda etapa se diseñaron y formaron de forma fractal nanogeles de ELRs mediante tecnología click sin catalizador (8). Estos geles dependiendo de la temperatura de formación tienen propiedades y tamaños diferentes que pueden ser aprovechados para dosificación de fármacos. Pudiendo encapsular fármacos con distinta hidrofobicidad dependiendo del método de formación del nanogel. En una tercera etapa se abordó la problemática la biointegración de prótesis reduciendo su rechazo por el organismo, y el encapsulamiento de sistemas celulares como pueden ser islotes pancreáticos que después puedan ser implantados como tratamiento contra la diabetes. Para ello se han formado microgeles mediante la técnica ¿layer by layer¿. Para lograr este objetivo se injertaron en superficies de distintos materiales (titanio, vidrio, poliestireno) los ELRs mediante una reacción de tipo ¿CLICK¿. Esto nos ha permitido obtener un enlace covalente de los biopolímeros con las superficies previamente activadas con un equipo de Plasma. Posteriormente se han realizado encapsulaciones de sistemas que imitan islotes pancreáticos (5). La caracterización de las superficies modificadas se ha llevado a cabo mediante técnicas muy variadas que abarcan tanto técnicas espectroscópicas y microscópicas como mecánicas, y físicas. Se obtuvieron también excelentes resultados que permiten la realización de pruebas in vitro e in vivo. ¿ RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL Se han modificado con éxito químicamente ELRs de forma que portan grupos funcionales que nos permitan entrecruzarlos en condiciones fisiológicas y citocompatibles para dar distintas estructuras que se detallarán más adelante. Estos ELRs modificados se han caracterizado mediante DSC, FTIR, RMN, análisis de aminoácidos y MALDI-ToF. Se ha llevado a cabo una caracterización minuciosa de las propiedades mecánicas de los ELRs-CFCGs, mediante medidas de reología, porosidad e hinchamiento. Se ha comprobado que este tipo de geles se pueden describir adecuadamente por un modelo poroviscoelástico, esto significa que a tiempos cortos la energía aplicada sobre ellos es disipada al movimiento del fluido entre los poros del gel y a la interacción de fluido con las paredes del poro, mientras que a tiempos largos tiene más influencia en estos procesos de relajación la reorganización de las cadenas y movimientos moleculares. Además los módulos elásticos y de pérdidas (G¿ y G¿¿) están en el rango de los obtenidos en los tejidos naturales, lo que nos indican que pueden ser utilizados en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Se ha comprobado que la funcionalidad de las secuencias bioactivas incluidas en el ELR como secuencias de adhesión celular (RGD o REDV) o secuencias sensibles a proteasas (VGVAPG) no se ha visto comprometida y siguen siendo bioactivas. (4) Se han formado geles híbridos, ELRs-FGs y caracterizado reológicamente. Obteniéndose que estos ELRs-FGs mejoran las propiedades mecánicas de los geles de fibrina e incorporan biofuncionalidades de forma controladas gracias al diseño inteligente de los ELRs. Se ha comprobado su citocompatibilidad con distintas líneas celulares observando cómo estas crecen normalmente desarrollando sus estructuras normales. Como prueba de concepto se han preparado válvulas aórticas que han mejorado las propiedades mecánicas de las análogas de fibrina sola. (6) Se han recubierto BMS con ELRs-CFCGs y tras medir su estabilidad al desgaste y desprendimiento del stent en condiciones fisiológicas se puede asegurar que son estables y que no producen residuos por desgaste mecánico. Se ha demostrado su citocompqatibilidad con células endoteliales y como la presencia de diversas secuencias bioactivas influyen en la proliferación de las mismas. Se ha demostrado la baja trombogeneicidad in vitro de estos nuevos dispositivos. Por lo que estos resultados nos animan a pasar a su implantación in vivo. (9) Se han formado válvulas aórticas de ELRs-CFCGs, las cuales han demostrado tener unas óptimas propiedades mecánicas siendo capaces de albergar y promover el desarrollo de células musculares lisas que forman su propia matriz extracelular mejorando y potenciado las propiedades del implante. Se ha demostrado como después de un mes de funcionamiento in vitro, en un bioreactor especialmente diseñado, estas válvulas siguen alcanzando la coaptación de las tres valvas y tras un análisis mecánico de las valvas y paredes se pudo comprobar que no solo no se habían deteriorado si no que el crecimiento de las células había potenciado sus propiedades mecánicas. Se ha propuesto y demostrado la formación fractal de nanogeles de ELRs mediante química click, estos han sido caracterizados y medido sus propiedades micro-reológicas y de carga superficial. Obteniéndose tamaños de 500 nm y 30 mV para los nanogeles formados a 37°C (por encima de su temperatura de transición) y de 150 nm y 10 mV para los formados a 4°C (por debajo de su temperatura de transición). Estos nanogeles han demostrado variar sus propiedades al cambiar la temperatura y recuperar las propiedades originales al recuperar la temperatura a la que fueron formados. Este tipo de nanogeles pueden ser empleados como sistemas de encapsulación de fármacos para su posterior dosificación. (8) Se ha conseguido biofuncionalizar sustratos de muy distintas características y composición química como son el titanio, poliestireno y vidrio mediante la técnica LbL con capas reactivas de ELRs, también se han recubierto mediante esta técnica stents coronarios y bolas de agarosa que imitan el tamaño de islotes pancreáticos. Estos recubrimientos han sido altamente efectivos al obtener capas homogéneas que recubren completamente los distintos materiales como se ha podido mediante diversas técnicas (XPS, AFM, SEM, microscopías ópticas y de fluorescencia, FTIR y ángulo de contacto) observándose como varían sus propiedades mecánicas, disminuyendo el módulo de Young con cada nueva capa haciéndose menos patente la influencia del sustrato subyacente. Estos resultados son prometedores para conseguir una correcta y total biointegración de implantes prostéticos como la encapsulación de sistemas celulares para el tratamiento de enfermedades como la diabetes. (5) OBJETIVOS LOGRADOS CON EL PROGRAMA DE FORMACION Gracias al programa de formación se ha conseguido el título de Máster Oficial en Técnicas Avanzadas en Química. Se ha obtenido el título de Capacitación para experimentación en ciencias del animal de laboratorio (Categoría B) y se está obteniendo el de categoría C impartido por Animalaria y reconocidos a nivel nacional por la comunidad de Madrid. Se han adquirido conocimientos y habilidades en cultivo celulares, ingeniería de tejidos y técnicas como XPS, SEM, crio-TEM, AFM, DSC, reología y micro-reología, potencial Z y DLS. Por último se obtendrá el título de doctor (muy probablemente antes de finalizar el año 2014) BIBLIOGRAFIA (1) Rodríguez-Cabello JC, Martín L, Alonso M, Arias FJ, Testera AM. ¿Recombinamers¿ as advanced materials for the post-oil age. Polymer 2009;50:5159-69. (2) Kolb HC, Finn MG, Sharpless KB. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angewandte Chemie International Edition 2001;40:2004-21 (3) Huisgen R. 1,3-Dipolar Cycloadditions. Past and Future. Angewandte Chemie International Edition in English 1963;2:565-98 (4) González de Torre I, Santos M, Quintanilla L, Testera A, Alonso M, Rodríguez Cabello JC. Elastin-Like Recombinamers Catalyst-Free Click Gels: Characterization of poroelastic and intrinsic viscoelastic properties. Acta Biomater. 2014, 10, 2495¿2505. (5) González de Torre I, Quintanilla L, Alonso M, Rodríguez Cabello JC. Surface modification by a reactive layer by layer technique based on clickable elastin-like recombinamers. Acta Biomater. (in press) 2014. (6) González de Torre I, Quintanilla L, Alonso M, Rodríguez Cabello JC Petra Mela, Stefan Jockenhoevel. Hybrid Elastin-Like Recombinamer-Fibrin Gels: Physical characterization and in vitro cell evaluation for cardiovascular tissue engineering applications, Acta Biomater. (in press) 2014 (7) Haugh, M.; Thorpe, S.; Vinardell, T.; Buckley, C.; Kelly, D., The application of plastic compression to modulate fibrin hydrogel mechanical properties. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 2012, 16, 66-72 (8) Gonza¿lez de Torre I, Quintanilla L, Pinedo-Martín G, Alonso M, Rodríguez-Cabello JC, Nanogel Formation from Dilute Solutions of Clickable Elastin-like Recombinamers and its Dependence on Temperature: Two Fractal Gelation Modes. Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 14509¿14515 (9) González de Torre I, Wolf F, Santos M, Rongen L, Alonso M, Jockenhoevel S,. Rodríguez-Cabello JC, Mela P. Elastin-like recombinamer-covered stents: towards a fully biocompatible and non-thrombogenic device for cardiovascular diseases Acta Biomater. (just accepted) 2014