Vitrificación como alternativa a las técnicas convencionales de criopreservación de esperma de caballo

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis El desarrollo de la crioconservación ha sido crucial para la conservación de recursos genéticos animales y mejora de la eficiencia reproductiva. Para ello, actualmente existen dos métodos: la congelación lenta y la vitrificación. En la congelación convencional se emplean crioprotectores (CPAs) penetrantes, siendo los espermatozoides muy sensibles a la toxicidad de estos. La vitrificación se ha desarrollado como alternativa a la criopreservación convencional. El objetivo de esta técnica es evitar la cristalización del agua, obteniendo un estado vítreo del medio. La técnica de vitrificación de esperma se basa en alcanzar un enfriamiento ultrarrápido mediante la inmersión directa en nitrógeno líquido, sin emplear CPAs permeables. Esta técnica ya ha sido aplicada con éxito en algunas especies animales, como en perro y cabra pirenaica. Sin embargo, al inicio de esta Tesis Doctoral, no existía ningún estudio en el que se realizase esta técnica de criopreservación con éxito en esperma de caballo. Por tanto, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado distintos protocolos de vitrificación espermática en la especie equina, como método alternativo de crioconservación. 2.contenido de la investigación En el Capítulo 1, se evaluó el empleo de sacarosa como estrategia para evitar el uso de crioprotectores permeables en la congelación de esperma de caballo. En el Capítulo 2, se desarrolló el método de vitrificación en esferas de esperma de caballo, valorando el efecto de diferentes concentraciones de crioprotectores no permeables, así como la temperatura del periodo de equilibrado sobre la calidad del esperma tras la vitrificación. En el Capítulo 3, se valoró la vitrificación de esperma de caballo en grandes volúmenes empleando pajuelas de 0,5 mL, atendiendo al efecto de diferentes métodos de calentamiento y a la selección espermática mediante coloides. En el Capítulo 4, se desarrolló un protocolo de vitrificación de esperma de caballo en pajuelas de 0,25 mL, tras la determinación de la concentración y volumen de esperma, así como del uso de azúcares y proteínas para esta técnica de vitrificación. En el Capítulo 5 se evaluó la capacidad fecundante del esperma vitrificado mediante fecundación in vitro (FIV) heteróloga, determinando previamente el método óptimo de calentamiento de las muestras vitrificadas. 3.conclusión El esperma de caballo puede ser congelado en ausencia de crioprotectores permeables, usando una combinación de 100 mM de sacarosa y 1 % de BSA como crioprotectores alternativos. El esperma de caballo puede ser vitrificado en esferas después del periodo de equilibrado a 5 ºC usando un diluyente en el que se combina 20 mM de sacarosa y 1 % de BSA, obteniendo mejores valores de los parámetros espermáticos que la congelación convencional con glicerol. La vitrificación de esperma de caballo en pajuelas de 0,5 mL obtuvo peor calidad del esperma que la congelación convencional y la vitrificación en esferas. Si bien distintos métodos de calentamiento no mejoraron la calidad del esperma, el uso de la centrifugación coloidal sí puede ser una estrategia para mejorar dicha calidad. No obstante, la vitrificación en pajuelas de 0,5 mL no puede ser considerada una alternativa a otras técnicas de criopreservación. El esperma de caballo puede ser vitrificado en pajuelas de 0,25 mL, con 100 μl de esperma a 100 x 106 espermatozoides/mL y empleando un medio con 100 mM de trehalosa y 1 % BSA. Igualmente, puede incorporarse al medio 0,25 % de LDL o 1 % de Pronexcell, a fin de mejorar la calidad del esperma. La vitrificación en pajuelas de 0,25 mL resultó en una mejor calidad del esperma en comparación con la congelación convencional. Las dosis vitrificadas de esperma de caballo pueden calentarse en un baño de agua a 60 ºC durante 5 s, como alternativa al método convencional de calentamiento de pajuelas vitrificadas. Las dosis de esperma de caballo vitrificado y congelado convencionalmente mostraron una capacidad fecundante similar, logrando penetrar a los ovocitos bovinos, dar lugar a la formación de pronúcleos y a la segmentación de embriones híbridos tras la FIV heteróloga. 4. bibliografía C Consuegra, F Crespo, M Bottrel, I Ortiz, J Dorado, M Diaz-Jimenez, B Pereira, M Hidalgo. (2018). Stallion sperm freezing with sucrose extenders: A strategy to avoid permeable cryoprotectants. Animal Reproduction Science.191.85-91. 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