Sintesis heterologa de Quimosina Bovina en Escherichia Coli para su uso en alimentacion

Resumen

La quimosina es una aspartil proteasa (o proteasa ácida) usada en la industria alimentaria para la elaboración de quesos. Naturalmente se produce en el cuajo de animales rumiantes jóvenes, pero con el avance de las técnicas del ADN recombinante para suplir la demanda que impone tanto el mercado como la industria especializada en la elaboración y fabricación de quesos. Así, en la presente tesis, hemos intentado desarrollar un nuevo sistema de producción heteróloga de esta proteína mejorando su hiperprodución por clonaje en Escherichia coli. El proceso ha consistido en el clonaje del gen de la proquimosina A bovina, optimizado en el uso de codones para E. coli, con el vector pBAD/His bajo el control del promotor PBAD inducible por L- arabinosa, por cuestiones económicas. La sobreexpresión del gen genera cuerpos de inclusión de proquimosina que son luego desnaturalizados por lavados con NaOH, para posteriormente replegar la proteína por dilución y ajuste de pH con glicina. Una vez plegada la proquimosina se activa la quimosina mediante un drástico cambio de pH. Las unidades de coagulación de leche (IMCUS) de quimosina recombinante que se han obtenido durante el proceso de fermentación una vez optimizado el proceso alcanzan aproximadamente 1000 U/L de cultivo por unidad de DO600. Como el proceso de activación/purificación tiene lugar a pHs muy ácidos, el control de este es algo complejo, por lo que buscamos nuevas alternativas para suplir este inconveniente. Tales alternativas fueron diseñar soportes sólidos y nanopartículas magnéticas para que, en un solo paso pudiéramos realizar todo el proceso de purificación y activación de la proteína