PROCEDIMIENTO PARA LA VALORACION DE LA VIABILIDAD DE NEOSPORACANINUM EN MUESTRAS DE SEMEN BOVINO.

Resumen

La presencia de N. caninum en muestras de semen bovino se cuantifica mediante una PCR cuantitativa en tiempo real, la cual utiliza el sistema SYBR Green I. Para la extracción del ADN del parásito de semen, se separa el fluido seminal de la fracción celular y se extrae el ADN de cada una de las fracciones utilizando una prueba comercial. Si es semen congelado con diluyente, la muestra se pasa a través de una columna de cromatografía de Sephacryl S-400 y el ADN se precipita con isopropanol y glicógeno. La cuantificación deN. caninum se realiza mediante interpolación del Ct (ciclo umbral: ciclo en el que una muestra es considera positiva) sobre una curva estándar construida con concentraciones conocidas de ADN del parásito frente a sus respectivos CT. Para la cuantificación del ADN del hospedador se realiza con otra curva estándar con concentraciones conocidas de ADN genómico. La viabilidad del parásito se confirma mediante bioensayo, inoculando a ratones BALBc nu/nu la fracción celular de lasmuestras de semen bovino. La aparición de síntomas compatibles con la infección y/o la cuantificación del ADN del parásito por PCR cuantitativa en muestras de encéfalo demuestra la viabilidad del parásito en la muestra seminal.