Design, Synthesis and Biological Evaluation of Therapeutic B2,2 -Sulfamidate-Containing Peptides

Resumen

A lo largo de esta Tesis Doctoral se han presentado varios resultados experimentales y teóricos, que permiten establecer estas conclusiones: Se ha estudiado la reactividad de sulfamidatos que presentan alfa-metilisoserina en su estructura combinando técnicas experimentales y cálculos computacionales. Se determinó que se puede controlar dicha reactividad dependiendo de los sustituyentes que tenga el sulfamidato en la posición N- o C- terminal. Si la posición N-terminal del sulfamidato no se encuentra protegida, las reacciones de tipo SN2 y E2 no tienen lugar. Sin embargo, cuando este se encuentra protegido con grupos carbonilo (carbamato o amida), se activa la reactividad en el carbono cuaternario y el grupo metilo terciario. Por otro lado, dependiendo del grupo que ocupe la posición C-terminal (ester o amida) se puede controlar la quimioselectividad de la reacción (SN2 vs E2). Se han conseguido acoplar alfa-aminoácidos en los extremos carboxilo y sulfonamida del sulfamidato en fase homogénea, obteniendo así una pequeña librería de alfa/beta2,2-di- y tri-péptidos hibridos. Algunos de ellos fueron activados protegiendo la posición N-terminal del sulfamidato en forma de acetamida y se llevaron a cabo reacciones de apertura con un nucleófilo débil empleado como disolvente (piridina), obteniendose alfa/beta2,2-di- y tri-péptidos hibridos cargados positivamente. Los experimentos de 2D-NOESY y simulaciones de dinámica molecular, confirmaron que estos péptidos cargados positivamente muestran interacciones aromáticas no covalentes entre el anillo aromático de los alfa-aminoácidos acoplados al sulfamidato y el grupo piridinio cuaternario. Se ha conseguido incorporar el sulfamidato en fase sólida para sintetizar péptidos de mayor tamaño y de interés biológico. En primer lugar se exploraran diferentes estrategias para incorporar el sulfamidato como building block en fase sólida y se diseñaron una nueva clase de rompedores de láminas beta (BSBP, en inglés) conformacionalmente restringidos basados en el core hidrofóbico de la proteína beta-amiloide (betaA), incorporando el sulfamidato de alfa-metilisoserina. Los péptidos que incorporan el sulfamidato son capaces de inhibir la agregación del betaA, tal y como se confirmó mediante análisis de fluorescencia de tioflavina-T y dicroísmo circular. Esta nueva familia de BSBPs pueden ser prometedores para el desarrollo de nuevos medicamentos para el tratamiento de enfermedades neurogenerativas como el síndrome de Alzheimer. Se han conseguido llevar a cabo reacciones de apertura en fase sólida sobre péptidos que contienen nuestro sulfamidato, presentando la ventaja de que la reacción es más eficiente y genera menos subproductos, simplificando el proceso de purificación. De esta manera, se han obtenido alfa,beta2,2-péptidos etiquetados químicamente, pre-funcionalizados para llevar a cabo química click y glicosilados con buenos rendimientos. Hemos diseñado un nuevo linker lábil, aprovechando la capacidad que posee el sulfamidato de alfa-metilisoserina para liberar los sustituyentes de tipo carbonilo unidos a su posición N-terminal. Se ha demostrado que la presencia de determinados nucleófilos en el medio o el pH del mismo afectan de manera significativa a esa reactividad, pudiendo ser usada esta estrategia para la liberación de fármacos y moléculas de interés biológico de forma controlada. Se han estudiado reacciones de apertura intramolecular de péptidos que contienen el sulfamidato de -metilisoserina, observando que grupos carbonilo unidos a su extremo N-terminal favorecen reacciones de N→S transacilación en lugar de apertura. Sin embargo, la presencia de grupos sulfonilo, como dansilo o nosilo en la misma posición, activa la reacción de apertura nucleófila intramolecular. Esta metodología fue usada para la síntesis de un nuevo análogo fluorescente del lantipéptido citolisina, CylLS, en el cual su anillo A incorpora el beta2,2-aminoácido, alfa-metil-beta-alanina (alfaMebetaAla). Durante mi estancia breve de investigación en el grupo del profesor Wilfred van der Donk (Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, EEUU), se diseñaron y sintetizaron inhibidores de proteasas, basados en una breve secuencia de consenso reconocida por la enzima para liberar los denominados leader peptides, antes de la excreción de lantipéptidos antimicrobianos al espacio extracelular. Estos péptidos se funcionalizaron con aldehídos y aceptores de Michael en su extremo C-terminal con el propósito de unirlos covalentemente a la enzima LahT150. La estructura del complejo enzima-inhibidor se resolvió cristalográficamente, proporcionando información sobre el sitio activo y el modo de unión y reconocimiento del sustrato peptídico.