Aplicación de nuevas estrategias bioquímicas y genéticas al estudio de la penicilina G acilasa de kluyvera citrophila

Resumen

Se han estudiado las bases moleculares implicadas en determinar la especificidad de sustrato de la pga de kluyvera citrophila. Así, se han obtenido mutantes con diferente especificidad de sustrato, mediante un proceso de presión selectiva, siendo localizados los residuos aminoácidicos responsables. La comparación de la secuencia de esta enzima con otras de la misma familia ha permitido realizar el diseño teórico de potenciales residuos estructural o funcionalmente importantes. Por otra parte, se ha investigado la posibilidad de emplear sustratos a los descritos clásicamente, determinando la capacidad de la pga de hidrolizar esteres de fenol. Este hecho ha permitido realizar el estudio cinético en el estado pre-estacionario, de la pga nativa y de la mutante adl, caracterizando el intermedio covalente acilenzima que se forma durante el proceso de catálisis. Asimismo, se ha llevado a cabo un estudio de la regulación y expresión del gen pac que codifica por la pga. Con este objetivo, se ha analizado el control que ejercen sobre la actividad pga diferentes factores, tales como: la temperatura, la represión catabólica y la inducción por ácido fenilacético, a nivel de transcripción y postraducional. Se ha identificado el promotor y demas elementos que participan en la regulación de la expresión del gen pac de k. Citrophila, y se han comparado con los responsables de controlar la expresión del gen pac de escherichia coli.