Estructura y dinámica de proteínas en condiciones de aglomeración macromoleculardesarrollo de métodos avanzados de espectroscopía láser de fluorescencia con resolución temporal de picosegundos

Zusammenfassung

Una característica común a todos los sistemas biológicos es su elevada concentración total de macromoléculas (50-400 mg/mL). Esta alta concentración de macromoléculas, tiene importantes efectos sobre la termodinámica y la cinética de las reacciones que tienen lugar en los medios fisiológicos. El estudio cuantitativo de las propiedades estructurales y de las interacciones en sistemas aglomerados, presenta dificultades experimentales y de interpretación para la mayoría de las técnicas biofísicas. El objetivo general de este trabajo es el desarrollo de métodos avanzados de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal de picosengudos y de FCS, adecuados para la obtención de información cuatitativa en medios aglomerados que simulan las condiciones de aglomeración macromolecular existente "in vivo". En este trabajo, se ha estudiado el efecto de la aglomeración macromolecular debida a altas concentraciones de Rnasa A o de HSA sobre el equilibrio de homodimerización de la apoMb así como sobre la difusión rotacional y translacional tanto del dímero como del monómero de apoMB. Las técnicas de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal han permitido detectar la formación de dímeros flexibles de apoMb en presencia de RNasa A como proteína aglomerante, en una proporción que aumenta al aumentar la concentración de RNasa A (0-250 mg/mL) y con constantes de asociación aparentes superiores a 10(5) -10(6) M, dependiendo de la concentración de RNasa A. En las soluciones de HSA como proteína aglomerante, la apoMb se mantiene monomérica en todo el intervalo de concentraciones de HSA estudiado (0-200 mg/mL). En diferente efecto observado sobre el equilibrio de dimerización de la apoMb es compatible con la menor exculsión de volumen en las soluciones de HSA que en las de Rnasa A para una misma concentración en mg/mL. En las soluciones de alta concentración de RNasa A o de HSA la microviscosidad que actúa sobre la difusión del monómero y el dímero de apoMb, es diferente de la viscosidad macroscópica y es distinta también para la difusión rotacional y translacional. Para los estudios de difusión translacional se utilizó la técnica de FCS. En ambos casos, existe una ley empírica potencial que relaciona la viscosidad microscópica en la macroscópica. La microviscosidad que actúa sobre la rotación es menor que la macroviscosidad y ésta a su vez es menor que la microsviscosidad translacional