Biotecnología aplicada a la mejora de "pelargonium"

Resumen

El trabajo se ha centrado en el género Pelargonium y en especial en el gerario zonal (Pelargonium x hortorum Bailey) debido al interés de esta planta como ornamental y a la disminución de la diversidad genética de esta especie debido al ataque masivo que está sufriendo por el taladro del geranio (Cacyreus marshalii Butler) en toda la Península y Baleares. La pérdida de los explantes iniciales debido a la oxidación fenólica se ha reducido lavando el material vegetal con una solución antioxidante después de su esterilización y antes de su introducción in vitro, se ha añadido al medio de cultivo un producto antioxidante (L-cysteina) y se han cultivado los explantes en la oscuridad durante la primera semana en las cámaras de cultivo. También se ha obtenido regeneración de plantas mediante embriogénesis somática utilizando como explantes raíces, cotiledones e hipocotilos de semillas germinadas in vitro. Los reguladores de crecimiento utilizados para la regeneración a partir de estos explantes y la forma de regeneración ha producido variaciones genéticas, no siempre deseables, pero que nos ha permitido desarrollar nuevas variedades debido al cambio de color de la flor y a una duplicación cromosómica. Se han obtenido plantas a partir de yemas laterales, hojas y pecicolos de plantas procedentes del invernadero y se ha puesto a punto la multiplicación a partir de explantes de plantas establecidas in vitro a partir de peciolos, hojas, yemas laterales y raíces. Se han estudiado 46 medios de regeneración para las plantas procedentes de invernadero. Los medios de cultivo consistieron en medio base LS con una combinación de 0; 0,1; 1 y 10 mg/L de las auxinas AIA con las citoquininas BAP y KIN. El mayor número de plántulas se obtuvo con una combinación de 10 mg/L de BAP y 1mg/L de ANA. Para la determinación de los medios de cultivo de los explantes procedentes de plantas cultivadas in vitro y basándonos en los resultados anteriores se utilizaron combinaciones de 0; 0,1; 1 y 10 mg/L de BAP y ANA con las sales de cultivo LS y B5 (Gamborg et al., 1968). Los mejores resultados se obtuvieron con el uso de sales LS para todos los explantes. Para la regeneración a partir de hojas el medio más adecuado para nuestras condiciones de cultivo contiene 1mg/L de BAP y 10mg/L de ANA y en el caso de yemas laterales y raíces el medio con 10mg/L de BAP y 1mg/L de ANA. Las plantas regeneradas mediante las diferentes técnicas se enraízan en medio LS sin reguladores de crecimiento. Las raíces producidas en este medio de cultivo permite una mejor aclimatación de los explantes a condiciones externas. La aclimatación se realiza en un invernadero mediante un sistema "fog-system" con una humedad del 70 al 90%. La mejor tasa de regeneración se ha obtenido a partir de yemas laterales y sobre todo a partir de raíces por lo que hemos seleccionado estos explantes para los experimentos transformación genética. Los ensayos de sensibilidad a antibióticos determinan que las variedades ensayadas son poco sensibles a kanamicina incluso a concentraciones de 400 mg/L y muy sensibles a higromicina. Los plásmidos construidos contienen un gen marcador para GUS o para GFP, un gen Cry de resistencia a la lepidópteros y en caso de incluir el gen de selección en planta. El gen de resistencia a higromicina. Las plantas transformantes obtenidas contienen el transgen, confirmándose tanto por ensayo histoquímico como por PCR