Genética molecular de la deficiencia eritrocitaria humana en piruvato quinasa

Resum

La piruvato quinasa (ATP: piruvato 5- O- fosfotransferasa; EC 2.7.1.40) cataliza la transformación de fosfoenolpiruvato y ADP en piruvato y ATP. Esta enzima, que aparece en todas las células vivas, es clave en la ruta central del metabolismo de los carbohidratos. En la especie humana han sido caracterizados dos genes diferentes: el PK-M que principalmente, codifica las isozimas del tejido musucular y de los leucocitos y la PK-LR que codifica las isozimas del hígado y de los eritrocitos. La deficiencia en piruvato quinasa, debido a una mutación en el gen PK-LR, origina alteraciones, únicamente, en el metabolismo de los eritrocitos, porque estas células no son capaces de compensar el defecto enzimático aumentando la síntesis de enzima mutada ni utilizar otras rutas degradativas. Por ello, la deficiencia de esta enzima es causa principal de la anemia hemolítica no esferocítica; los síntomas clínicos de esta enfermedad abarcan desde un estado hemolítico compensado hasta una anemia grave que pude provocar incluso la muerte de los pacientes. Los métodos clásicos para estudiar las variantes con deficiencia piruvato quinasa han sido estandarizados por la Comisión Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH). Sin embargo, la interpretación de los resultados bioquímicos de las enzimas deficientes en la actividad piruvato quinasa se ve dificultada por la alta frecuencia de heterocigotos que conducen a enzimas híbridas con diferentes propiedades moleculares. Además, debido a la baja actividad de la enzima en los eritrocitos de los pacientes, estos requieren constantemente sangre y la caracterización de la enzima deficiente se ve dificultada por las actividades de la enzima de los eritrocitos normales del donante y del producto del gen PK-M de los leucocitos. Estos problemas han llevado a estudiar la enzimopatía eritrocitaria piruvato quinasa mediante técnicas de Biología Molecular, utilizando fundamentalmente la amplificación del gen PK-R mediante la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación nucleotídica del mismo. Los resultados, así obtenidos, han proporcionado un diagnóstico exacto de la enfermedad, marcan la pauta a seguir en el transcurso de la misma y facilitan la aplicación de una terapia adecuada. El trabajo se realizó sobre 10 pacientes, no relacionados familiarmente, con deficiencia en piruvato quinasa eritrocitaria y anemia hemolítica no esferocítica. No se ha podido establecer una correlación directa entre el nivel de actividad de la enzima y el grado de alteración clínica observada. Mediante el análisis molecular se han encontrado 11 mutaciones diferentes en los 17 alelos mutados; tres de estas mutaciones, G694A, A1150G y G1154A, no habían sido previamente descritas. Los estudios de modelización molecular han permitido observar notables modificaciones en la estructura local de la molécula, originadas por mutaciones que inducen desajsutes en el balance de las cargas eléctricas y/o impedimientos esféricos. Estas mutaciones se corresponden, asimismo, con disminución de la actividad piruvato quinasa, como demuestran los bajos niveles de esta actividad en pacientes portadores de dichas mutaciones