Biología molecular y caracterización inmunológica de dos alergenos principales del polen de olivoOle e 1 y Ole e 9

Résumé

En el presente trabajo de investigación se ha producido una isoforma (clon 3c) y un mutante no glicosilado de Ole e 1, alergeno principal del polen de olivo, como proteinas recombinantes en la levadura P.pastoris. Las proteinas recombinantes obtenidas son secretadas al medio extracelular por la levadura a partir de donde se han purificado, mediante dos etapas cromatograficas,con un alto rendimiento. Se ha realizado la caracterización molecular, estructural e inmunologica de las proteinas recombinantes, demostrandose su equivalencia con la proteina natural. Tambien, se ha validado la eficacia de la forma recombinante de Ole e 1 en el diagnostico de los pacientes alergicos a olivo. Por otro lado, se ha purificado un nuevo alergeno del polen de olivo, Ole e 9, a partir del extracto salino, mediante tres etapas cromatograficas. El alergeno Ole e 9 es una glicoproteina acida, constituida por una unica cadena polipeptidica con una masa molecular de 46,4 kDa, que presenta polimorfismo y que se expresa exclusivamente en el polen. El estudio de la frecuencia de sensibilización de los pacientes alérgicos a polen de olivo a este nuevo alergeno ha mostrado que se trata de un alergeno principal. Mediante clonación de su cDNA se ha determinado su secuencia primaria y uno de los clones obtenidos ha sido producido de forma recombinante en la levadura P.pastoris. Ole e 9, ademas de presentar actividad alergénica, presenta actividad endoglicolitica como se ha demostrado mediante los correspondientes ensayos enzimáticos. El trabajo de investigación presentado en esta memoria ha aportado una serie de resultados que han permitido, por un lado, validar el sistema de expresion en la levadura P.pastoris para la produccion de alergenos que presentan modificaciones postraduccionales,como Ole e 1 y Ole e 9, y por otro lado, se ha logrado el aislamiento, la caracterizacion molecular e inmunologia, y la producción recombinante de un nuevo alergeno principal del polen de olivo.