Estructura, procesamiento proteolítico y activación de la proteína F del virus respiratorio sincital humano

Resumo

La glicoproteina F del virus respiratorio sincitial humano fusiona las membranas viral y celular. La proteina F y un mutante al que se han eliminado la region transmembrana y citoplasmatica (F TM-) se expresaron a partir de vaccinias recombinantes y se purificaron por cromatografia de inmunoafinidad. Mediante el analisis del comportamiento en SDS-PAGE, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, susceptibilidad a digestion con tripsina, comportamiento en ultracentrifugacion en gradientes de sacarosa y microscopia electronica, se determino que las proteinas F y F TM- tienen una estructura similar, por lo que el ectodominio de la proteina se pliega independientemente. Mediante microscopia electronica se identificaron dos conformaciones de la proteina que, probablemente, correspondan a las formas pre- y post-activas. Estudios de inmunomicroscopía electronica de la proteina F dieron información de la localización en la estructura tridimensional de los sitios antigénicos de la proteina. La caracterización de la forma sin procesar (FO), parcialmente procesada (F A1-109) y totalmente procesada (F1+F2) de las proteinas F TM- y F mediante reactividad frente a sueros especificos, secuenciacion N-terminal y espectrometria de masas, demostro que la proteina F sufre un doble procesamiento proteolítico durante su maduración (tras el residuo 109, sitio I y el residuo 136, sitio II). El corte en ambos sitios es independiente, como se determinó mediante mutagenesis dirigida, pero posiblemente primero se produzca en el sitio I. Además, por ensayos de inmunoprecipitacion con un suero especifico de las formas FO y Fa1-109, se determinó que F1+F2, y F0 y/o F A1-109 pueden cooligomerizar en el trimero de proteina F TM-y que el peptido entre los dos sitos de procesamiento no se encuentra en la proteina madura. Por ultimo, preparaciones de proteina F TM-procesadas en el sitio II aparecieron con la conformacion post-activa, lo que sugiere que el procesamiento proteolitico tras ese sitio es el evento que dispara el cambio conformocional entre las conformaciones pre- y post-activas de la proteina.