Identificación y caracterización de antígenos de "Neospora caninum" con interés inmunodiagnóstico en bovinos

Resumen

Neospora caninum es un protozoo Apicomplexa que afecta fundamentalmente el ganado bovino y está considerado como uno de los agentes transmisibles productores de aborto más importante en esta especie doméstica. La detección de anticuerpos específicos en el ganado bovino se viene realizando como técnica de rutinaria de diagnóstico para poner en evidencia la infección por N.caninum en los animales adultos y se utiliza como técnica complementaria en el diagnóstico de las neosporosis en fetos abortados. Sin embargo, el diagnóstico serólogico presenta una serie de limitaciones. Por otra parte, la identificación y caracterización de los antígenos inmunodominantes de N.caninum abre las puertas al desarrollo de nuevas pruebas inmunodiagnósticas más sensibles y específicas. El presente estudio confirmó la existencia de dos poblaciones bovinas serológicas independientes -fetos y reproductoras- y justificó la necesidad de emplear diferentes puntos de corte para cada una de las técnicas serológicas en función de la edad del animal y el objetivo de la técnica (diagnóstico de la infección o del aborto). En el caso de las reproductoras infectadas se recomendó el empleo de dos puntos de corte distintos, uno para máxima sensibilidad y otro para máxima esepcificidad junto con el western blot, únicamente, con el objetivo de confirmar los resultados dudosos. Cuando se estudió el patrón de reconocimiento en el ganado bovino infectado se reconocieron 4 antígenos inmunodominantes de 17-18, 34-35, 37 y 60-62 kDa. En concreto, la identificación de la fracción antigénica de 17-18 kDa fue el mejor marcador de la infección y estuvo directamente implicado en las fluctuaciones de los títulos de anticuerpos que tienen lugar durante la gestación en las reproductoras infectadas que abortan, razón por la cual se sugirió su empleo como marcador diagnóstico de reactivación en los animales infectados a priori de forma crónica. A continuación se estudió la utilidad diagnóstica del antégeno inmunodominante de 17-18 kDa -p-17- en la prueba de western blot. La p-17 demostró tener un elevado valor diagnóstico con independencia de la edad de los animales, razón por la cual podría ser un candidato ideal para el desarrollo de futuras pruebas diagnósticas serológicas basadas en antígenos recombinantes. Finalmente, se abordó la caracterización del antígeno inmunodominante de N.caninum -p-17- con interés en el inmunodiagnóstico siguiendo dos aproximaciones diferentes y complementarias. Para ello se planteó la identificación de los genes codificadores del antígeno de interés. Mediante la construcción de una genoteca de cDNA de taquizoítos de N.caninum y el cribado de ésta con anticuerpos policlonales específicos dirigidos frente a la fracción proteica de 17 kDa (APA-17). Se detectó de forma mayoritaria el clon 4.1 que contiene una fase de lectura que codifica para la proteína de gránulos densos GRA7. La elevada especificidad del anticuerpo APA-17 y el reconocimiento del clon 4.1 apuntaron a la posibilidad de que la p-17 podría proceder de un procesamiento proteolítico de la proteína GRA7 o la existencia de epítopos compartidos entre ambas proteínas. Al realizar la caracterización de la p-17 mediante electroforesis en geles bidimensionales y western blot se comprobó que dicha fracción estuvo compuesta por 4 polipéptidos