Desarrollo de vacunas frente a la neosporosis bovina utilizando aislados de "Neospora caninum" inactivados y atenuados

Resumen

Neospora caninum es un parásito intracelular formador de quistes considerado mundialmente como una de las principales causas de aborto en el ganado bovino.La magnitud de las pérdidas económicas asociadas a la neosporosis bovina, junto con la ausencia de medidas económicamente viables para su control, han conducido a que uno de los principales retos en la investigación sobre esta enfermedad sea el desarrollo de una vacuna eficaz, segura y rentable frente al aborto y la transmisión del parásito. En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios para el desarrollo de vacunas frente a las neosporosis bovina, incluyendo vacunas inactivadas, vivas, y de nueva generación basadas en proteínas recombinantes, en vectores vivos o en vacunas de ADN. Las vacunas de nueva generación ofrecen alternativas interesantes para el futuro pero los resultados de protección obtenidos hasta el momento son insuficientes. Por el contrario, las únicas vacunas que hasta la fecha se han probado en la especie de destino con cierto éxito utilizan parásitos inactivados y vivos atenuados, hecho que dio pie a la realización de la presente tesis doctoral. En la primera parte del estudio, se evaluó el efecto protector de formulaciones empleando parásito entero inactivado como antígeno. En este tipo de vacunas, la selección apropiada de determinadas variables, como el tipo de antígeno o el adyuvante, puede ser determinante para la inducción de una respuesta inmunoprotectora frente a la infección por N. caninum. Por ello, en un primer experimento se evaluó la influencia de tres adyuvantes (emulsión oleosa de agua en aceite -W/O- e hidróxido de aluminio combinado con CpG -Al/CpG- o extracto de Ginseng -Al/G-) en combinación con tres dosis diferentes de taquizoítos enteros inactivados (105, 5×105 y 106) en un modelo murino de neosporosis cerebral (Capítulo II). En este estudio se puso de manifiesto la influencia del adyuvante en la eficacia protectora de la vacunación. Así, la inmunización de W/O combinado con 5×105 taquizoítos limitó la presencia del parásito en el cerebro en la fase crónica y, por tanto, la posible cronificación y persistencia de la infección en este órgano, mientras que el adyuvante Al/G combinado con 5×105 taquizoítos redujo la parasitemia durante la fase aguda. La dosis de antígeno afectó, aunque de forma menos notable que el adyuvante, la eficacia protectora de la vacunación, de manera que en los grupos inmunizados con Al/G, la frecuencia y cargas parasitarias en el cerebro se incrementaron con la dosis. Para el siguiente estudio (Capítulo III), se seleccionaron los adyuvantes y dosis de antígeno que mejores niveles de protección mostraron en el modelo cerebral, y se estudió su capacidad protectora en un modelo de infección congénita. Por un lado, se seleccionaron el adyuvante W/O y la dosis de 5×105 taquizoítos, ya que dicha combinación redujo la infección cerebral, sugiriendo una posible protección frente a la cronificación de la infección. Por otro lado, se probó el adyuvante Al/G y la dosis de 5×105 taquizoítos frente a la infección congénita, ya que sus efectos reductores de la parasitemia en la fase aguda podrían también ayudar a controlar la transmisión transplacentaria del parásito a la descendencia tras una reactivación o una primoinfección en la hembra gestante. Adicionalmente, se comparó el efecto entre estas formulaciones y aquellas elaboradas a partir de una mezcla de antígenos procedentes de los estadios de taquizoíto y bradizoíto (TZ-BZ). La hipótesis de partida fue que estas últimas pudieran conferir protección frente a los procesos de reactivación en los que está implicado el estadio de bradizoíto. Sin embargo, la inmunización con la mezcla de TZ-BZ mostró los peores resultados de protección, originando una exacerbación de las infecciones cerebral y congénita, asociada a un probable desequilibrio de la respuesta inmunitaria caracterizado por una sobreexpresión de citoquinas de tipo Th1 tras la inmunización y de tipo Th2 tras el desafío. Por el contrario, la combinación de W/O y taquizoítos indujo un equilibrio de la respuesta inmunitaria caracterizado por una elevada producción de anticuerpos, predominantemente de tipo Th2, y con una sobreexpresión de IFN-?, que controló parcialmente la infección cerebral y la transmisión vertical. En la segunda parte del estudio, se investigó el desarrollo de una vacuna viva atenuada frente a la infección por N. caninum. Para ello, la estrategia de partida fue la obtención y caracterización de un aislado a partir de un animal asintomático que mostrara cierta atenuación en su virulencia (Capítulos IV y V). Como fruto de esta aproximación, se obtuvo el aislado Nc-Spain 1H de N. caninum a partir de un ternero clínicamente sano pero congénitamente infectado. Dicho aislado se identificó genéticamente mediante el análisis de 13 secuencias microsatélites previamente identificadas en el genoma de N. caninum, mostrando un patrón definido y exclusivo. Los ensayos de caracterización in vitro mostraron un bajo rendimiento en la producción de taquizoítos y una menor capacidad de infección del aislado Nc-Spain 1H en comparación con el aislado de referencia Nc-1. Durante su caracterización biológica in vivo, el aislado Nc-Spain 1H mostró una virulencia notablemente reducida en un modelo murino de infección cerebral y congénita, caracterizada por una menor persistencia en el cerebro de ratones y una virulencia reducida con ausencia de signos clínicos y bajas tasas de mortalidad y transmisión vertical de la infección a las crías. En un modelo bovino gestante, dicho aislado no produjo mortalidad fetal y no se detectó presencia del parásito en los tejidos fetales.