Un motivo clave en la proteína Orc4p para el ensamblaje del complejo iniciador de la replicación en S. cerevisae

Resumen

El Complejo de Reconocimiento del Origen en la levadura Saccharomyces cerevisiae (ScORC) es el arquetipo de los iniciadores de la replicación en eucariotas. Está formado por seis subunidades (ScOrc1-6p) que se unen al DNA, dirigiendo el correcto ensa mblaje de la maquinaria replicativa. Nuestro trabajo previo demostró que la subunidad ScOrc4p interacciona con chaperonas de la familia Hsp70 o con su homólogo Dnak en Escherichia coli. Mediante un análisis proteómico del complejo formado entre ScOrc 4p y DnaK, hemos encontrado en la segunda hélice-? del Initiator Specific Motif (ISM) de ScOrc4p una secuencia hidrofóbica (IL4, residuos 184-188) que es la diana principal de estas chaperonas. La coexpresión en E. coli de Orc4p junto a Orc1,2,3,5p y Cdc6p muestra que Orc4p interacciona con Orc1p, Orc2p y Orc5p y más débilmente con Cdc6p. Realizamos mutagénesis dirigida en el motivo IL4 por cinco alaninas y hemos observado que si bien la mutación no altera la estructura de Orc4p, sí que afecta a su interacción con la subunidad Orc2p. Por otro lado, la sustitución alélica en ORC4 de mutantes en cada residuo del motivo IL4 muestra que mientras que la mutación L184A es letal para la célula, las mutaciones L185A y L186A dan como resultado un fe notipo termosensible que hace que estas estirpes tengan un defecto en el inicio de replicación. En resumen, estos resultados nos hacen postular que las chaperonas de la familia Hsp70 desempeñan un papel importante en el ensamblaje del complejo ORC.