Estudio bioquímico, genético y fisiológico de la degradación intracelular de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas putidaaplicaciones biotecnológicas

Resumen

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva que muchas bacterias sintetizan en condiciones de desequilibrio nutricional y exceso de fuente de carbono, muy interesantes desde el punto de vista industrial por sus propiedades similares a l as de los plásticos de la industria petroleoquímica. Además, todos los monómeros de 3-hidroxiácidos incorporados en la molécula son enantioméricamente puros y de la forma R, por lo que se ha planteado el uso de los PHAs como fuente de estos valiosos sintones. Dependiendo del microorganismo productor y de la fuente de carbono suministrada los PHA pueden ser scl-PHA (PHA de cadena corta, a partir de monómeros de hasta 4 átomos de carbono) o mcl-PHA (PHA de cadena media, con monómeros de 5 o mas át omos de carbono). Los genes implicados en la síntesis y degradación de PHA en las bacterias del género Pseudomonas son phaC1 y phaC2, codificantes de polimerasas; phaZ, codificante de una despolimerasa; phaD, que codifica una proteína reguladora de l a familia TetR y phaI y phaF, codificantes de las fasinas PhaF y PhaI. En esta Tesis Doctoral se ha analizado en profundidad la expresión del gen phaZ de la cepa modelo en biotecnología ambiental P. putida KT2442 en relación al resto de los genes del cluster mediante RT-PCR en tiempo real. Así, se ha determinado que existen dos promotores principales que dirigen la transcripción de los genes pha, PC1 y PI. De igual modo, se ha estudiado el efecto del medio de cultivo sobre la transcripción de ph aZ y la localización de la proteína PhaZ en el interior celular. Dicha enzima ha sido purificada a homogeneidad electroforética y caracterizada bioquímicamente. De igual modo, se han analizado los productos de reacción, mediante LC-MS y ESI-MS. En un a siguiente aproximación se ha realizado una comparación entre despolimerasas intra y extracelulares del género Pseudomonas. De este análisis se extrajo la información necesaria para realizar experimentos de mutagénesis al azar sobre PhaZ de KT2442, obteniendo versiones mutantes de la enzima con actividad esterasa y despolimerasa aumentada. Por último, se han diseñado aplicaciones biotecnológicas para la obtención de 3-hidroxiácidos y oligómeros enanitopuros utilizando cepas productoras de despo limerasas intra y extracelulares de Pseudomonas.