Caracterización molecular de aislados de "Mycobacterium avium" subespecie "paratuberculosis"

Résumé

La paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enfermedad crónica granulomatosa que afecta principalmente al aparato digestivo de rumiantes domésticos, aunque la infección puede presentarse además en otras especies. El agente etiológico está incluido dentro del complejo Mycobacterium avium y se denomina M. a. paratuberculosis. El objetivo del trabajo presentado en esta tesis se basa en el desarrollo y aplicación de nuevas herramientas de caracterización molecular rápidas aplicadas a M. a. para tuberculosis; focalizadas en la descripción y el empleo de estas nuevas metodologías para caracterizar los aislados de crecimiento más lento (tipos I y III). Todos estos estudios se enmarcaron dentro de dos proyectos, AGL2005-07792 (Ministerio de Ciencia e Innovación de España) y ParaTBTools FP6-2004-FOOD-3B-023106 (Unión Europea). Mediante las técnicas moleculares tradicionales, actualmente empleadas, como PFGE e IS900-RFLP las cepas de M. a. paratuberculosis se dividen en tres tipos; tipo I ( también denominado ¿ovino¿), II (¿bovino¿) y III (¿intermedio¿). Sin embargo, cabe destacar que la caracterización molecular de algunos aislados y en especial los de crecimiento más lento (tipos I y III) mediante estas técnicas no puede ser realizada debido a los requerimientos de ADN necesarios para llevarlas a cabo (tanto en calidad como en cantidad). Además, estas técnicas destacan por su complejidad y por lo tanto son difíciles de aplicar de manera rutinaria en la caracterización molecular d e M. a. paratuberculosis. La necesidad del desarrollo de nuevas técnicas moleculares rápidas, menos laboriosas y costosas capaces de discriminar entre los tres tipos de cepas de M. a. paratuberculosis nos dirigió a esta línea de trabajo. Por este motivo comenzamos con el diseño de técnicas de PCRs para amplificar genes de expresión constitutiva (house-keeping genes) que posteriormente se secuenciaron para hallar diferencias específicas únicas para cada uno de los tres grupos de cepas. De éstos, los genes gyrA y gyrB, topoisomerasas implicadas en la regulación de la estructura helicoidal del ADN, presentaron SNPs específicos de cada tipo (I, II y III). Al mismo tiempo, uno de los SNPs del gen gyrB en las cepas del tipo III presentaba una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Hpy188III. La restricción enzimática de las cepas de tipo III (genéticamente y fenotípicamente hasta la fecha únicamente diferenciables de las del tipo I mediante PFGE e IS900-RFLP) eran...