Impacto del estrés térmico y del daño nuclear espermático en la viabilidad embrionaria y en la proporción de sexos en el ratón

Resumen

El estrés térmico y la fragmentación del ADN espermático son dos factores muy influyentes en la fertilidad de los animales domésticos. El estrés térmico afecta tanto a la calidad embrionaria como a la calidad seminal. Sin embargo, en lo que respecta al desarrollo embrionario, no se conoce con precisión cómo afecta a los estadios tempranos de desarrollo y si los embriones de diferente sexo pueden responder de distinta forma al citado estrés. En cuanto a los gametos masculinos, se conoce muy poco cómo el estrés térmico puede afectar la calidad espermática, y las consecuencias que puede desencadenar en los embriones resultantes de la fecundación con estos gametos. Uno de los parámetros a tener en cuenta cuando se habla de calidad espermática es la fragmentación del ADN de los espermatozoides (una de las consecuencias del estrés térmico); no se conoce de forma precisa la relación existente entre este parámetro y la capacidad fecundante de los espermatozoides ni los efectos que para el desarrollo embrionario puede tener. En este trabajo se planteó, en primer lugar, conocer cuáles son las diferencias en la susceptibilidad al estrés térmico entre embriones de distinto sexo durante el desarrollo preimplantacional y determinar cuáles son los mecanismos moleculares responsables de las citadas diferencias; en segundo lugar, determinar cómo el estrés térmico puede alterar tanto el desarrollo embrionario preimplantacional (in vivo e in vitro) así como la espermatogénesis, utilizando como modelo experimental el ratón; y en tercer lugar, averiguar qué condiciones pueden favorecer un aumento en el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado y las consecuencias sobre el desarrollo embrionario y fetal, ya sea tras la utilización de la monta natural o mediante una técnica de reproducción asistida, como es la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Para abordar estos objetivos, se diseñaron tres ensayos. En el primer ensayo se analizó el efecto del estrés térmico sobre embriones producidos in vitro e in vivo; utilizando, por una parte, embriones cultivados in vitro, y por otra parte, aplicando el estrés térmico sobre las hembras en los primeros días de gestación (in vivo). En primer lugar se analizó la supervivencia de los embriones de sexo masculino y femenino tras la aplicación del estrés térmico in vitro, observándose un incremento en la supervivencia en los embriones de sexo femenino. Otra de las diferencias observadas entre embriones de distinto sexo cultivados in vitro bajo las citadas condiciones, fue su velocidad de desarrollo; los embriones de sexo masculino se desarrollaron más rápidamente que los de sexo femenino. Con el fin de evaluar cuáles pueden ser las causas de la diferente supervivencia entre embriones de distinto sexo, se procedió a determinar la concentración relativa de peróxido de hidrógeno (H2O2) en embriones en estadio de mórula sometidos a estrés térmico in vitro, y posteriormente se analizó el sexo de los mismos, observándose que en los embriones de sexo masculino la concentración relativa de H2O2 era superior a la observada en los embriones de sexo femenino sometidos al estrés térmico. Por otra parte, otro grupo de embriones fue cultivado in vitro a 37ºC hasta el estadio de blastocisto, determinándose el sexo de los mismos y la abundancia relativa del ARNm de genes importantes Resumen en el desarrollo embrionario. Se observó que la expresión de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6pdx), un gen ligado al cromosoma X y relacionado con el estrés oxidativo, era mayor en los embriones de sexo femenino. Como hipótesis a contrastar, se planteó que la mayor supervivencia de los embriones de sexo femenino en estadios de desarrollo temprano, ante situaciones de estrés térmico, era debida a un aumento en la expresión G6pdx a diferencia de lo que ocurre en los embriones de sexo masculino. Para evaluar el posible efecto protector frente al estrés térmico de la actividad G6PD, se inhibió esta enzima a través de la utilización de dehidroepiandrosterona (DHEA). Se comprobó que, tras la inhibición de G6PD, las diferencias inicialmente observadas entre embriones de distinto sexo cultivados in vitro y causadas por el estrés oxidativo provocado por el aumento de temperatura, desaparecían. Se demostró experimentalmente que G6PD interviene en los mecanismos por los cuales los embriones de sexo femenino, en estadios preimplantacionales, son más resistentes que los de sexo masculino ante situaciones de estrés térmico. En el segundo ensayo, se eligió también el estrés térmico como factor ambiental con impacto sobre la fertilidad de los animales. En este caso, el estrés térmico fue aplicado de forma local sobre los testículos de los ratones con el fin de evaluar el daño del estrés térmico sobre las células germinales del testículo y los espermatozoides presentes en el epidídimo. En diferentes momentos tras el tratamiento térmico (6 horas, 7, 14, 21, 28 días), se recogieron los espermatozoides de la cola del epidídimo y del conducto deferente y se evaluaron diferentes parámetros espermáticos. Paralelamente, se utilizó otro grupo de animales tratados para establecer cruces con hembras en los momentos señalados después del estrés térmico; adicionalmente, se evaluó el porcentaje de hembras gestantes, la tasa de implantación embrionaria y el sexo de los fetos concebidos por estos machos. Los resultados indicaron que un tratamiento térmico moderado y por un corto período de tiempo afecta de diferente manera a los distintos tipos de células germinales masculinas, produciendo un incremento de la fragmentación del ADN espermático en el período de 0 a 28 días después del estrés térmico. Cuando las células dañadas fueron espermatocitos, los animales eran subfértiles. Sin embargo, los espermatozoides formados a partir de las espermátidas afectadas mostraron los niveles más elevados de fragmentación del ADN, sin que la fertilidad de los machos se viera alterada. Cuando los afectados por el estrés térmico fueron los espermatozoides presentes en el epidídimo, observamos una distorsión de la proporción de sexos de la descendencia a favor de las hembras. En el tercer ensayo se persiguió como objetivo conocer los mecanismos implicados en la fragmentación del ADN espermático y a la vez, establecer las consecuencias que sobre el desarrollo embrionario y la fertilidad del individuo tiene la utilización, mediante ICSI, de muestras espermáticas con un elevado grado de fragmentación del ADN. Para ello, las muestras de espermatozoides recogidas de la cola del epidídimo y del conducto deferente fueron incubadas en diferentes condiciones antes de la determinación de la fragmentación del ADN espermático. Las condiciones elegidas fueron tres: a) un medio habitualmente utilizado para la manipulación de los Resumen embriones de ratón, medio M2; b) un medio llamado medio condicionado (MC), en el que se encuentran todos los componentes (p.ej. endonucleasas) liberados por espermatozoides a los que se les ha dañado su membrana plasmástica mediante congelación-descongelación, en ausencia de crioprotectores y c) el medio MC suplementado con EDTA, quelante de Ca2+ y Mg2+, cofactores esenciales para la actividad de las endonucleasas. Observamos que el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado es mayor en las muestras incubadas en MC respecto al valor observado en el grupo control, sin embargo, este porcentaje no es diferente al del control cuando los espermatozoides son incubados en MC suplementado con EDTA. En conclusión, existen factores presentes en los medios que contienen espermatozoides con daño en su membrana plasmática capaces de inducir fragmentación del ADN en espermatozoides tratados. Estos factores necesitan la presencia en el medio de iones, como el Ca2+ o el Mg2+, para poder actuar. Finalmente, las muestras incubadas en MC en las que habíamos observado un incremento de la fragmentación del ADN espermático, se utilizaron para fecundar ovocitos mediante ICSI, utilizando como control espermatozoides no incubados. Tras la realización de ICSI, se observó que la incubación de los espermatozoides en MC no afectaba a la tasa de fecundación, ni al número ni a la morfología de los blastocistos; sin embargo, la tasa de implantación se vio significativamente reducida, lo que indicó un efecto negativo sobre la calidad embrionaria que se manifiesta en estadios perimplantacionales. Concluimos que los factores liberados por espermatozoides con la membrana dañada pueden, además de inducir fragmentación del ADN en los espermatozoides tratados, reducir los porcentajes de implantación de los embriones producidos con dichos espermatozoides.