PHB despolimerasas de "Streptomyces exfoliatus y Streptomyces ascomycinicus"caracterización de enzimas con potencial aplicación biotecnológica

Abstract

Los polihidroxialcanoatos (PHAs), son una clase de polioxoésteres lineales hidrofóbicos,sintetizados y acumulados por una amplia variedad de bacterias y arqueas, para servir de reservorio de carbono y energía cuando hay un desequilibrio en las condiciones del medio, porun exceso de fuente de carbono y falta de algún nutriente esencial.Los PHAs poseen propiedades similares a los termoplásticos; además son los únicos bioplásticos producidos enteramente por microorganismos, son totalmente biodegradables y se producen a partir de fuentes renovables. El PHA más abundante y mejor conocido es el polihidroxibutirato (PHB), que es un PHA de cadena corta, en contraste con los PHAs de cadena media, que tienen cadenas laterales de 3 o más carbonos.Los PHAs son producidos intracelularmente como gránulos citoplásmicos con una capa superficial de proteínas y lípidos. En estos gránulos o carbonosomas, los PHAs se encuentran en un estado amorfo y fluido, pero cuando la capa proteica se daña, o el PHA queda expuesto al medio extracelular, el polímero adopta una estructura parcialmente cristalina, llamada PHA desnaturalizado o dPHA.La degradación enzimática de PHAs puede implicar dos procesos diferentes: La degradación intracelular de PHA es el proceso por el cual la célula acumuladora de PHA moviliza su reserva para crecer cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables tras un proceso de desequilibrio. Es realizada por PHA despolimerasas intracelulares, enzimas hidrolíticas asociadas a la superficie del gránulo de PHA.En cambio, la degradación extracelular de PHA es un proceso por el cual un microorganismo, (no necesariamente productor de PHA) secreta PHA despolimerasas solubles para hidrolizar dPHA, presente en el medio como resultado de la lisis celular de bacterias productoras de PHA, usando los productos resultantes como fuente de carbono alternativa en ausencia de sustratosmás adecuados.La degradación de PHAs es un proceso interesante, no sólo con el objetivo de paliar la acumulación de residuos plásticos en el medio ambiente, sino también por la posibilidad de usar los productos de reacción como compuestos quirales de alto valor añadido para la síntesis de polímeros con propiedades a medida y de gran variedad de fármacos quirales enantioméricamente puros.Tras examinar la actividad PHA despolimerasa extracelular de varias cepas de Streptomyces seprocedió a clonar los genes codificantes de las PHB despolimerasas de S. exfoliatus (PhaZSex) y S. ascomycinicus (PhaZSa), respectivamente, para expresarlos en Rhodococcus sp. T104. Así seconsiguió producir ambas enzimas en forma activa y extracelular. Estas despolimerasas fueron purificadas mediante cromatografía de interacción hidrofóbica, y posteriormente se sometieron a una exhaustiva caracterización funcional, que incluyó identificación de lospéptidos señal, espectrometría de masas, análisis de especificidad de sustrato, identificación de los productos de reacción y análisis de los efectos de pH, temperatura, fuerza iónica y presencia de múltiples reactivos sobre la actividad y estabilidad de las enzimas. También se realizó un estudio cinético de la degradación de PHB por PhaZSex y PhaZSa, y se emplearon para degradar películas de PHB y copolímeros con 3-hidroxivalerato o almidón.Asimismo, se analizaron las estructuras secundarias y terciarias de ambas enzimas por dicroísmo circular, modificación de aminoácidos y mutagénesis dirigida.Finalmente, se inmovilizaron ambas enzimas mediante diferentes métodos con el fin dedesarrollar biocatalizadores para la degradación de PHB, y se empleó PhaZSex liofilizada para catalizar reacciones de síntesis orgánica en medios no acuosos.