Terapia génica y reprogramación celular en un modelo experimental de anemia de Fanconi con mutaciones en el gen "Fancd1-Brca2"

Resumen

La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad heterogénea, cuya característica principal es el fallo de médula ósea, además de anomalías en el desarrollo y alta predisposición al desarrollo de tumores. Está causada por mutaciones en uno de los 16 genes descritos que participan en la ruta AF BRCA implicada en reparación de entrecruzamientos en las cadenas del DNA. El gen causante más frecuente es FANCA, pero mutaciones en genes como FANCD1 BRCA2, implican una mayor severidad de la enfermedad, probablemente por su implicación en reparación del ADN mediante recombinación homóloga. El único tratamiento curativo para el fallo de médula ósea de pacientes AF, es el trasplante de células madre hematopoyéticas (CMHs) a partir de donante compatible sano, pero en AF resulta complejo debido a la hipersensibilidad de sus células. Una opción terapéutica sería la terapia génica para corregir el defecto genético, pero requiere cierto número de CMHs para ser transducidas con el vector terapéutico y esto resulta limitante. Gracias a la reprogramación celular sería posible obtener células con pluripotencia inducida (iPSCs) a partir de células adultas que permitiría la generación de un elevado número de CMHs autólogas corregidas genéticamente, para su reinfusión en el paciente. El modelo de ratón con mutaciones hipomórficas en el gen Brca2 Fancd1, que fue caracterizado en nuestro laboratorio es uno de los que mejor reproduce el fenotipo hematopoyético de la FA, y es con el que hemos desarrollado gran parte de este trabajo.Puesto que hasta la realización de nuestro trabajo se desconocía cuál era la relevancia del gen Brca2 en reprogramación celular, el primer objetivo de esta Tesis fue investigar su relevancia en reprogramación celular. En segundo lugar desarrollar un protocolo combinado de terapia génica y reprogramación celular para la generación de iPSCs corregidas genéticamente, que serían sometidas a diferenciación hematopoyética. Por último exploramos la funcionalidad de estas células mediante trasplante en ratones afectados por la enfermedad. La generación de iPSCs mediante transducción de células con vectores de reprogramación mostró que Brca2 es crítico para la obtención de células con características de iPSCs. La corrección del defecto genético en fibroblastos y su transducción con un vector lentiviral de reprogramación policistrónico y escindible permitió la reprogramación eficaz de las células. El análisis de formación de focos de reparación de la proteína RAD51 durante la reprogramación demostró que el mecanismo de HDR se dispara durante este proceso; estando ausente en células Brca2D27D27, pero activo en células sin mutaciones en genes AF o con mutaciones en el gen Fanca. Estos resultados explican el papel crítico de la proteína BRCA2 en HDR. Puesto que durante la reprogramación de células Brca2D27D27 se produjo un incremento en la apoptosis responsable, al menos en parte, de la muy baja eficiencia de reprogramación que caracteriza a estas células. Las caracterización molecular y funcional de iPSCs procedentes de fibroblastos Brca2D27D27 corregidos genéticamente permitió observar que estas células cumplían la mayor parte de los criterios para ser considerados bona fide- iPSCs, aunque solo tras la escisión completa del casete de reprogramación fueron capaces de generar teratomas en ratones inmunodeficientes y por tanto células iPSC completamente reprogramadas bona fide-iPSCs que expresaban el ARNm de BRCA2 y foci de RAD51.Tras la escisión del vector de reprogramación se selecionó un subclón. Éste a pesar de ser seleccionado por mantener un cariotipo normal mostró inestabilidad genética cuyo origen pudo ser debido al proceso de reprogramación, mantenimiento en cultivo o a la escisión. Finalmente, la diferenciación hematopoyética de iPSCs Brca2D27D27 corregidas permitió la producción de células que expresaban marcadores característicos de CMH y no fueron capaces de reconstituir su sistema hematopoyético.