Caracterización de las factorías virales y complejos replicativos ensamblados por virus ARN

Resumen

Los virus son patógenos intracelulares que necesitan la maquinaria de la célula huésped para propagarse. Muchos virus ARN y algunos ADN realizan la replicación y transcripción del genoma en el citoplasma de células eucariotas, generando estructuras especializadas denominadas factorías virales. La finalidad de dichos compartimentos es mejorar la eficacia de la replicación y proteger al genoma viral frente al sistema inmune de la célula huésped. En el presente trabajo de tesis se estudiaron, con técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, las factorías y complejos replicativos (CRs) ensamblados por distintos virus ARN: tombusvirus , bunyavirus y reovirus.Tombusvirus induce la formación de un sistema complejo de membranas donde se lleva a cabo la replicación viral en estructuras limitadas por membranas o esférulas. Las secciones seriadas y reconstrucciones tridimensionales (3D) mostraron que el compartimiento estaba rodeado por mitocondrias y retículo endoplásmico (RE). La técnica METTEM (metal tagging transmission electron microscopy) permitió visualizar las moléculas de replicasa viral en las membranas del compartimento, así como su incorporación y activación en las esférulas. El estudio de factores celulares implicados en la formación del complejo de replicación demostró que la proteína ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) Vps4 es un componente estable del CR activo, necesaria para la formación y mantenimiento de las esférulas virales. En levaduras donde el gen pah1 ha sido delecionado, el orgánulo de replicación se asocia con RE formando una plataforma altamente especializada. Con METTEM y tomografía electrónica se mostró que en las regiones del compartimento donde la replicasa está activa, las moléculas presentan un alto grado de empaquetamiento.El virus Bunyamwera (VBUN) ensambla mini-factorías en células Vero, formadas por fragmentos del aparato de Golgi rodeados de mitocondrias y RE. El modelo 3D reveló la presencia de contactos entre mitocondrias y RE con CRs y virus intracelulares. Se demostró que la nucleoproteína N y la polimerasa L son suficientes para la formación del CR funcional, reclutamiento de mitocondrias y RE constituyendo la factoría, y para el ensamblaje de pseudo-partículas virales. Las moléculas de polimerasa L se acumulan en membranas intracelulares y se concentran formando agregados densos compatibles con esférulas virales. Durante la infección por VBUN, se reclutan las proteínas mitocondriales p32 y Mfn2, y la miosina-9 a la factoría viral. La presencia de Mfn2 sugiere que esta proteína podría mediar los contactos entre mitocondrias y entre mitocondrias y membranas del RE. P32 siempre acompaña a los elementos de la factoría viral, sugiriendo que podría actuar como factor importante en replicación y/o morfogénesis viral. Los resultados con el tratamiento de blebistatina indican un posible papel de la miosina-9 en el transporte de RNPs desde los sitios de replicación a los lugares de ensamblaje.Modelos 3D mostraron que las inclusiones de reovirus están formadas por un entramado de membranas y microtúbulos, rodeado por mitocondrias y retículo endoplásmico rugoso (RER). En el área de salida de virus, cerca de la membrana plasmática, las partículas virales contactan con membranas del RE y microtúbulos. Este hecho apunta a un nuevo mecanismo que podría mediar la salida de reovirus sin lisis celular.Por lo tanto, los virus ARN estudiados en este proyecto ensamblan los CRs en asociación con membranas y orgánulos celulares. Mediante METTEM y tomografía electrónica se observó que las moléculas de polimerasa viral dentro de los CRs activos muestran un alto nivel de empaquetamiento. Además, se ha demostrado que varias proteínas celulares tienen un papel en la formación y mantenimiento del orgánulo de replicación. Los datos obtenidos constituyen un primer paso para el estudio de las vías celulares implicadas en la biogénesis de las factorías virales.