Desarrollo de anticuerpos monoclonales frente a "Nosema ceranae" como aportación al diagnóstico del síndrome de despoblamiento

Resumen

La nosemosis afecta a las abejas en todo el mundo y está causada por los microsporidios Nosema apis y Nosema ceranae. Ambas especies infectan el intestino de A. mellifera, aunque N. ceranaeparece ser más patógena, y se ha relacionado con los colapsos de las colmenas. Aunque por su morfología las esporas de Nosema sp. pueden visualizarse con microscopio óptico (MO), el diagnóstico de especie es difícil ya que las mayores diferencias son ultraestructurales y requieren la utilización de microscopía electrónica de transmisión (MET) o de técnicas moleculares. Estas técnicasson caras y poco accesibles para muchos laboratorios, por lo que el objetivo principal del trabajo fue la obtención de anticuerpos monoclonales (AcMc) frente a N. ceranae y N. apis, para el desarrollo de una inmunofluorescencia indirecta (IFI) que permita identificar ambas especies.En primer lugar se obtuvieron sueros policlonales frente a N. ceranae y N. apis, inoculando esporas de estas especies en conejos Nueva Zelanda. Los sueros de las sangrías realizadas durante la inmunización se titularon mediante IFI tanto frente a la especie homóloga como frente a especies heterólogas de microsporidios. Al contrario que los sueros obtenidos frente a N. apis, los sueros del lote frente a N. ceranae no mostraron reacción cruzada con ninguna especie heteróloga, por lo que uno de ellos se seleccionó para llevar a cabo la técnica de IFI que identificara esta especie.Dicha técnica se validó comparando sus resultados con los obtenidos en el Centro Apícola Regional (CAR) mediante MO y PCR múltiple, en el diagnóstico de muestras de colmenas. La IFI con suero policlonal, mostró en el Test Diagnóstico sensibilidad y especificidad mayores que la MO y similares a la PCR múltiple (técnica de referencia).Más adelante, se obtuvieron AcMc frente a N. ceranae. Para ello se inocularon ratones BALB/c con esporas de esta especie, y sus esplenocitos se fusionaron con células de mieloma obteniendo hibridomas. Entre aquellos que secretaban el Ac deseado (seleccionados con IFI), se escogieron cuatro: F1.6F10 frente a Nosema sp., F1.7D2 y F4.1B11 específicos de N. ceranae y F4.9G2, específico de N. apis. Éstos se expandieron, se clonaron y, una vez estabilizados, se inocularon en ratones BALB/c para su producción en elevadas concentraciones en ascitis.Para carcterizar los AcMc, se determinó el isotipo (IgM en todos los casos), se realizaron estudios de IFI para conocer su reactividad frente a su especie homóloga y otras especies heterólogas de microsporidio, y se determinó su patrón de inmunorreconocimiento frente a N. apis y N. ceranae, mediante Western Blot.En el desarrollo de la IFI empleando los AcMc, se seleccionaron diluciones que permitieran la detección sin reacciones cruzadas con otras especies. Para la validación, se compararon sus resultados y los obtenidos con la IFI con suero policlonal, la MO y la PCR múltiple en el diagnóstico de las muestras utilizadas anteriormente. F1.6F10 (frente a Nosema sp.) presentó sensibilidad y especificidad similares a las de la MO y muy cercanas a las de la PCR. F1.7D2 y F4.1B11, frente a N. ceranae, presentaron una sensibilidad cercana a la de la PCR y superior a la de la MO. Aunque las especificidades de IFI y MO fueron similares, al estudiar pormenorizadamente los resultados la MO mostró un mayor número de falsos diagnósticos. Por último, F4.9G2 reveló menor sensibilidad que la MO para la detección de N. apis pero su especificidad fue mayor y más cercana a la de la PCR.Debido a los resultados mostrados, la técnica de IFI desarrollada podría ser una herramienta útil para el diagnóstico de la nosemosis en las colmenas, pudiendo utilizarla como una alternativa de menor coste, o en combinación con las técnicas ya existentes para una mejor detección e identificación de las distintas especies del parásito.