Modelo de levadura humanizada mediante expresión de la proteína oncogénica PI3Kaplicación a la búsqueda de inhibidores y al estudio de la señalización lipídica

Resumen

Las fosfatidilinositol-3 quinasas de clase I (PI3K) son proteínas de mamífero que fosforilan el PtdIns-4,5P2 en posición 3¿ dando lugar PtdIns-3,4,5P3 en la membrana plasmática. Este segundo mensajero es reconocido por la proteín quinasa Akt, que de esta forma se localiza en la membrana donde es activada para regular a su vez un gran número de efectores intracelulares, que finalmente favorecen la proliferación celular e inhiben la apoptosis. El principal regulador negativo de esta ruta es la fosfatasa PTEN, que convierte PtdIns-3,4,5P3 en PtdIns-4,5P2. La hiperactivación de esta vía es una causa frecuente de la aparición y el desarrollo de tumores en mamíferos. Nuestro equipo de investigación ha desarrollado un sistema de levadura humanizada mediante expresión de los principales elementos de esta ruta, ausentes de forma natural en este organismo modelo. La expresión de una versión de la subunidad catalítica de PI3K que está dirigida artificialmente a la membrana plasmática, p110alfa-CAAX, origina la inhibición del crecimiento de la levadura. Este efecto puede ser empleado para la investigación aplicada, tanto para la realización de estudios funcionales de las proteínas oncogénicas PI3K y Akt como para la búsqueda de compuestos que inhiban su actividad. A lo largo de este trabajo hemos puesto a punto un bioensayo de inhibición de PI3K en levadura utilizando diferentes inhibidores específicos de esta proteína mediante estrategias que favorecen el aumento de las concentraciones intracelulares de los compuestos ensayados. Estas condiciones nos han permitido emplear este bioensayo a escala piloto con una colección de extractos de origen microbiano, en colaboración con la plataforma HTS de la Fundación MEDINA, para la búsqueda de extractos con actividad inhibidora sobre PI3K. De 9600 extractos rastreados, 55 mostraron actividad frente a esta proteína de forma reproducible, específica y dosis-dependiente.Además, el sistema de levadura humanizada también puede emplearse en investigación básica, como herramienta para el estudio de las funciones de su sustrato, el PtdIns-4,5P2, en este organismo. La falta de PtdIns-4,5P2 origina la pérdida de polaridad del citoesqueleto de actina y provoca diversas alteraciones en el tráfico intracelular de vesículas. Por otro lado hemos demostrado que la eliminación de PtdIns-4,5P2 inducida por expresión de PI3K causa en la levadura la activación de una cascada se señalización intracelular, denominada ruta de integridad celular, mediada por la MAPK Slt2, dando lugar a una respuesta transcripcional característica de la estimulación de esta ruta en condiciones de daño sobre la pared celular. Hemos puesto de manifiesto que algunos de los componentes que gobiernan las primeras etapas en esta ruta, Wsc1, Pkc1, Rho1, y que participan en la señalización en condiciones de eliminación de PtdIns-4,5P2 se encuentran localizados de forma anómala en endosomas de reciclaje, en lugar de la membrana plasmática, su ubicación habitual. Posiblemente desde estos compartimentos transmiten la señal de activación a la cascada de MAPKs. Por último, hemos llevado a cabo un rastreo sobre la colección genómica de mutantes delecionados en genes no esenciales de levadura para la búsqueda de procesos regulados por PtdIns-4,5P2, empleando una versión miristoilada de p110alfa que inhibe el crecimiento de la levadura parcialmente. Hemos hallado diversos mutantes en los que el efecto de inhibición de crecimiento se agrava, relacionados con la traducción proteica y con el aparato de Golgi; y otros en los que este efecto se alivia, relacionados con el procesamiento del RNA y con la señalización celular. Algunos de los resultados obtenidos permiten explicar aspectos que hemos observado en la situación experimental que causa la expresión de p110 en levadura y otros aportan nuevos indicios acerca de la participación del PtdIns-4,5P2 en funciones celulares no descritas hasta el momento en este organismo.