Estudio de microRNAs implicados en la respuesta renal a isquemia-reperfusiónidentificación como nuevos biomarcadores de daño renal agudo

Resumen

La insuficiencia renal aguda (IRA) es un síndrome clínico complejo que presenta una alta tasa de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. A pesar de la intensa investigación de las últimas décadas, los métodos de diagnóstico del daño renal y su terapéutica han experimentado pocos avances, probablemente debido a que las herramientas clínicas actuales ofrecen una información de diagnóstico tardía. La identificación de nuevos mecanismos moleculares implicados en la patofisiología de la IRA es esencial para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico y el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas. Los microRNAs son reguladores post-transcripcionales implicados prácticamente en todos los procesos celulares. Son reguladores finos de la información genética y crecientes evidencias ha demostrado que están implicados en los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a numerosas de enfermedades, incluyendo nefropatías. En este trabajo hemos identificado y caracterizado varios miRNAs como mediadores clave de la respuesta del túbulo proximal al daño por Isquemia/Reperfusión (I/R). Así mismo, hemos desvelado el papel de estos miRNAs como biomarcadores diagnósticos, pronósticos y de predisposición de IRA. Para ello hemos utilizado un modelo in vivo de I/R renal en rata, así como un modelo in vitro en células proximales tubulares que reproduce todos los estímulos y eventos observados in vivo. Adicionalmente, hemos utilizado muestras de suero de pacientes con IRA procedentes de dos cohortes: Pacientes de unidades de cuidados intensivos y pacientes sometidos a cirugía cardiaca. Utilizando estos modelos experimentales de I/R y por medio de microarrays y análisis mediante qRT-PCR, hemos demostrado que miR-127 se modula durante isquemia y también durante la reperfusión tanto in vivo como in vitro. Experimentos de interferencia in vitro demostraron que la inducción isquémica de miR-127 es mediada por la estabilización del Factor Inducible por Hipoxia-1? (HIF-1?). Así mismo, miR-127 está implicado en el mantenimiento de la adhesión célula-célula y célula-matriz, ya que la sobreexpresión de miR-127 mantiene el ensamblaje de los complejos de adhesión focal y la integridad de las uniones estrechas. miR-127 regula también el tráfico intracelular. De hecho, hemos identificado por primera vez en este trabajo el miembro 3B de la familia de la Kinesina (KIF3B), molécula clave para el tráfico intracelular, como una diana real de miR-127 en células proximales tubulares de rata. Así mismo, como los miRNAs pueden ser detectados en fluidos corporales extracelulares, y basándonos en nuestros resultados obtenidos en modelos experimentales, hemos identificado y validado un panel de 10 miRNAs en suero, incluyendo miR-127, como biomarcadores de IRA en pacientes. Un experimento de cribado inicial llevó a la selección de un panel de miRNAs en suero que fueron posteriormente validados en una cohorte de pacientes de UCI con daño renal, así como en una cohorte de pacientes de cirugía cardiaca con circulación extracorpórea. Los experimentos de validación demostraron que nuestro panel de miRNAs en suero son biomarcadores diagnósticos de IRA con una especificidad y sensibilidad cercana al 100%. Además, los miRNAs séricos pueden detectar el desarrollo de IRA antes que el incremento de creatinina, demostrando que son herramientas de diagnóstico precoz. Los miRNAs séricos proporcionan información clínica adicional valiosa, ya que los niveles de miRNAs en suero correlacionan con la severidad del daño renal y pueden discriminar entre daño renal de origen renal o pre-renal, así como entre sus etiologías. Así mismo, los niveles de miRNAs en suero, estimados antes de la cirugía, pueden predecir el desarrollo posterior de daño renal, lo que demuestra su valor como biomarcadores de predisposición de IRA. [ABSTRACT]Acute Kidney Injury (AKI) is a complex clinical syndrome which presents very high morbidity and mortality rates in developed countries. Despite the intense research of the last decades, AKI diagnosis and therapeutic approaches have undergone few advances, probably due to the fact that current clinical tools offer late diagnosis information. Identification of new molecular mechanisms involved in AKI pathophisiology is essential for development of new diagnostic and prognostic tools as well as discovery of new therapeutic targets. microRNAs (miRNAs) are post-transcriptional regulators of almost every cellular process. They have been unveiled as fine-tuners of genetic information and accumulating evidence has demonstrated that they are at the bases of the pathophysiological mechanism of a wide range of disorders, including nephropaties. In this work, we have identified and characterized several miRNAs as key mediators of the proximal tubule response to I/R injury. Moreover we have point out these miRNAs as AKI diagnostic, prognostic and predisposition biomarkers. For this purpose, we have used an in vivo model of renal ischemia/reperfusion in rat as well as an in vitro model in proximal tubule cells which closely mimics the stimuli and features observed in vivo. Additionally, we have used serum samples of AKI patients from two cohorts: Intensive Care Unit patients and cardiac surgery patients. Using these experimental models of I/R and by means of microarrays and qRT-PCR analysis, we demonstrated that miR-127 is modulated during ischemia and also during reperfusion, in vivo and in vitro. In vitro interference approaches demonstrated that ischemic induction of miR-127 is mediated by Hypoxia Inducible Factor-1alpha (HIF-1?) stabilization. Moreover, miR-127 is involved in cell-matrix and cell-cell adhesion maintenance, since overexpression of miR-127 maintains focal adhesion complex assembly and tight junctions’ integrity. miR-127 also regulates intracellular trafficking. In fact, we have identified for the first time in this work the Kinesin Family Member 3B (KIF3B), key molecule in cell trafficking, as a target of miR-127 in rat proximal tubule cells. Moreover, since miRNAs can be detected in extracellular body fluids, and based in our findings using experimental models, we have identified and validated a panel of 10 serum miRNAs, including miR-127, as biomarkers of AKI in patients. An initial screening experiment led to a panel of serum miRNAs which were validated in bigger cohorts of ICU patients with AKI and patients who underwent cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Validation experiments demonstrated that our panel of miRNAs are powerful diagnostic biomarkers of AKI with sensitivity and specificity close to 100%. Moreover, serum miRNAs detect AKI development before serum creatinine increases, becoming early diagnostic tools. Serum miRNAs provide additional valuable clinical information since miRNA levels in serum correlate with AKI grade and can distinguish between pre-renal and intrinsic AKI origin as well as among AKI etiologies. Moreover, serum miRNAs levels estimated before surgery can predict AKI development later on, becoming biomarkers of AKI predisposition.