Estudios estructurales y funcionales de la lisozima Cpl-7, del bacteriófago Cp-7 de neumococo

Resumen

S. pneumoniae es uno de los principales patógenos causantes de enfermedades como la meningitis, neumonía y otitis, entre otras, siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en niños y adultos en el mundo. Las infecciones por neumococo se han venido tratando rutinariamente con antibióticos y, para su prevención, se están administrando vacunas. Sin embargo, en las últimas décadas y debido al abuso en el consumo de antibióticos se han diseminado cepas multirresistentes que amenazan con inutilizar dichos antibióticos y desembocar en un serio problema de salud pública. En este contexto, el desarrollo de tratamientos alternativos capaces de prevenir y erradicar las infecciones neumocócicas se ha convertido en una cuestión urgente. En este sentido la denominada terapia fágica se ha revitalizado después de muchas décadas de casi total abandono y, hoy en día, se están utilizando los viriones enteros o algunos de sus productos como método alternativo (o, en ocasiones, complementario) para luchar contra las infecciones bacterianas en general. En el sistema de neumococo, las mureín-hidrolasas, tanto de la bacteria como de los fagos que la infectan, muestran una gran especificidad por el sustrato porque todas ellas poseen un dominio de unión a colina y sólo son activas en presencia de este aminoalcohol. Hay una sola excepción en este conjunto de enzimas, la lisozima Cpl-7 que está codificada por el fago lítico Cp-7 y presenta un módulo totalmente independiente de este aminoalcohol. En este trabajo, se ha secuenciado completamente el genoma del fago Cp-7. Además, dada la eficacia de las endolisinas fa¿gicas de neumococo Cpl-1 (lisozima) y Pal (amidasa) para ser empleadas como agentes antibacterianos específicos frente a neumococo, se han estudiado las características enzimáticas de Cpl-7, así como el efecto bactericida que esta lisozima puede presentar frente a diferentes cepas de neumococo, incluidas multirresistentes. Por otro lado y dado la carga negativa que las bacterias Gram-positivas presentan en su superficie, se ha realizado un estudio exhaustivo de la carga de los diferentes elementos estructurales de la lisozima Cpl-7 con el objetivo de obtener una variante sintética de Cpl-7 con actividad antimicrobiana mejorada, obteniendo así una variante sintética denominada Cpl-7S. Esta variante sintética presenta una inversión de la carga neta de su módulo de reconocimiento del sustrato gracias a la modificación de 15 aminoácidos (5 en cada repetición CW_7), mostrando un aumento de la actividad lítica frente a S. pneumoniae (incluyendo diferentes capsuladas y multirresistentes), Streptococcus pyogenes y otros patógenos. Además, una acción combinada de carvacrol 0.01% (un aceite esencial) y Cpl-7S, un protocolo diseñado para desestabilizar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, era capaz de hacer que Escherichia coli, Pseudomonas putida, así como otros patógenos de gran importancia clínica, fueran susceptibles a la acción de dicha lisozima , un efecto no descrito previamente.Por otro lado y debido a la modulación de esta enzimas, se ha desarrollado un batería de enzimas quiméricas (Cpl-711, Cpl-771, Cp-117 y Cpl-177), resultantes de la combinación de los diferentes elementos estructurales de la lisozima de origen fágico Cpl-1 y la proteína sintética Cpl-7S. Todas estas nuevas enzimas se ensayaron como antes, en paredes celulares purificadas y sobre cultivos de células vivas, y se encontró que Cpl-711 era la más activa, incluso más potente que el Cpl-1 que, hasta ahora, era el arma más letal contra diferentes cepas de neumococo. Por último, en este trabajo se han validado todos los estudios in vitro mediante la utilización de tres modelos animales de infección. Un modelo de embriones de pez cebra, siendo la primera vez que se emplea este modelo animal con éxito para medir el efecto protector de un compuesto antibacteriano, y dos modelos murinos (colonización nasal y sepsis).