Nucleósido 2'-desoxirribolsiltransferasa de "Bacillus psychrosaccharolyticus" CECT 4070

Résumé

Los análogos de nucleósidos son moléculas que presentan actividad antiviral y antitumoral y que han sido sintetizados tradicionalmente mediante métodos químicos, necesitando pasos de protección y desprotección de grupos. Por ello, la síntesis de los mismos mediante nucleósido 2¿-desoxirribosiltransferasas es una alternativa interesante por el empleo de condiciones de reacción suaves y la estereo y regioselectividad alcanzada. Estas enzimas catalizan la transferencia del grupo 2¿-desoxirribosa entre un 2¿-desoxirribonucleósido y una base púrica o pirimidínica libre y se clasifican en dos clases dependiendo de la especificidad de sustrato: tipo I (PDT), específicas para purinas, y tipo II (NDT), que catalizan la transferencia entre purinas y/o pirimidinas.Los microorganismos psicrotolerantes presentan su temperatura óptima de crecimiento a 20-40 oC, pero son capaces de crecer a temperaturas cercanas a 0 oC. Bacillus psychrosaccharolyticus (CECT 4074, ATCC 23296, DSM 6) es una bacteria Gram-positiva, anaerobia facultativa, clasificada como psicrotolerante en la que se ha detectado actividad nucleósido 2¿-desoxirribosiltransferasa.RESULTADOS1.Identificación, clonación, expresión del gen que codifica la nucleósido 2¿-desoxirribosiltransferasa de B. psychrosaccharolyticus. Purificación de BpNDT.La secuenciación del genoma de B. psychrosaccharolyticus permitió la identificación de la secuencia del gen ndt. Esta se clonó en pET28a(+) y se sobreexpresó en E. coli BL21(DE3). La proteína obtenida se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico, seguida de penetrabilidad e isoenfoque, obteniéndose una única banda proteica de 16 kDa.2.Caracterización bioquímica y estructural de BpNDT recombinanteBpNDT se clasificó como DRT de tipo II (NDT) ya que acepta bases púricas y pirimidínicas. Se determinaron las condiciones óptimas para la actividad de BpNDT, 40 oC y pH 8. Además, la actividad óptima se mantuvo en presencia de NaCl hasta que se sobrepasó 1.0 M. Únicamente los cationes Co2+El estudio del mecanismo catalítico de BpNDT indicó que sigue un mecanismo ping-pong Bi-Bi, con formación de un intermedio glicosil-enzima., Cu2+, Mn2+ y Zn2+ presentaron efecto inhibitorio sobre la actividad de BpNDT.El estudio del mecanismo catalítico de BpNDT indicó que sigue un mecanismo ping-pong Bi-Bi, con formación de un intermedio glicosil-enzima.BpNDT es un homohexámero con masa molecular 91,400 Da y cuya estructura secundaria está formada por 36% de alpha-hélice, 16% de lámina beta, 16,6% de giros beta y 31,6% de estructura desordenada. La estructura cuaternaria se determinó mediante cristalización empleando la técnica de reemplazo molecular en base a las coordenadas atómicas de la 2¿-desoxirribosiltransferasa de Lactobacillus helveticus (PDB 1s2d). La unidad asimétrica de BpNDT está formada por dos cadenas polipeptídicas que se ensamblan formando un dímero. A su vez, tres estructuras diméricas se asocian para formar un hexámero (trímero de dímeros). Cada dímero presenta dos centros activos, cada uno de ellos compuesto por aminoácidos de las dos subunidades del dímero. Por último, la temperatura de desnaturalización de BpNDT es 49 oC.3.Síntesis de nucleósidosEl estudio de la especificidad de sustrato indicó que BpNDT acepta distintas bases naturales y no naturales como sustratos, pero muestra preferencia por purinas como aceptores y nucleósidos pirimidínicos como donadores. Además, se llevó a cabo la síntesis de diferentes nucleósidos halogenados y púricos modificados, siendo la primera vez que algunos de ellos fueron sintetizados por una enzima NDT. 4.Inmovilización de BpNDTBpNDT se inmovilizó mediante adsorción iónica sobre agarosa funcionalizada con polietilenimina, y se entrecruzó posteriormente con dextrano aldehídico para prevenir la desorción de la enzima.