Estudio de la regulación negativa por proteín fosfatasas de las rutas de señalización mediadas por MAPKs de apareamiento e integridad celular en "Saccharomyces cerevisiae"

Resumen

Todas las células poseen la capacidad de detectar y generar respuestas coordinadas frente a diferentes estímulos y cambios medioambientales. Entre los dispositivos moleculares más frecuentemente utilizados para llevar a cabo estas respuestas se encuentran las rutas de transducción de señales mediadas por MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases), altamente conservadas a lo largo de la evolución en los organismos eucarióticos. Se componen de un módulo básico de tres quinasas cuya activación se produce de forma secuencial por fosforilación, dando lugar finalmente a una respuesta transcripcional apropiada. Dado el papel esencial que desempeñan, estas rutas precisan una rigurosa regulación tanto de la magnitud como de la duración de la señal. El hecho de que la cascada de MAPKs se active mediante fosforilación hace que las serin-treonín fosfatasas, las tirosín fosfatasas y las fosfatasas de especificidad dual sean elementos esenciales en la regulación de la señalización. Nuestro estudio se ha enfocado, por una parte, en la regulación negativa que ejercen las fosfatasas de especificidad dual Msg5 y Sdp1 sobre la MAPK de la ruta de integridad celular Slt2 y la pseudoquinasa Mlp1 en la levadura Saccharomyces cerevisiae. A través del sistema de dos híbridos y de ensayos de copurificación in vivo e in vitro hemos identificado un nuevo motivo (IYT) localizado en la región N-terminal de ambas fosfatasas y conservado en ortólogos de otras especies fúngicas que está implicado en la interacción con Slt2 y Mlp1. A diferencia de lo que ocurre en la unión de Msg5 con las MAPKs de la ruta de apareamiento Fus3 y Kss1, en la interacción con Slt2 y Mlp1 no se encuentra involucrado ni el motivo D (Docking domain) de la fosfatasa ni el dominio CD (Common Docking) de la MAPK o la pseudoquinasa. Por tanto, nuestros experimentos han puesto de manifiesto un mecanismo de unión alternativo al ya descrito previamente basado en la unión electrostática entre los residuos ácidos del CD de las quinasas y los básicos del motivo D de las fosfatasas. La existencia de formas de unión específicas y distintas de una misma proteína con sus sustratos indica la complejidad de la modulación de la señal en estas rutas. Asimismo, con el fin de encontrar nuevos reguladores negativos de las rutas de apareamiento e integridad celular, se realizaron rastreos que evaluaron el efecto de la sobreexpresión individual de 43 genes (que codifican proteín fosfatasas o subunidades asociadas a ellas) sobre la inhibición del crecimiento provocada por la expresión de alelos hiperactivos que activan estas rutas en distintos niveles. El escrutinio sobre la ruta de apareamiento se desarrolló mediante la sobreexpresión de Ste4, la subunidad ß de la proteína G heterotrimérica, mientras que se activó la ruta de integridad celular de dos maneras posibles: a través de la expresión de un alelo hiperactivo de Pkc1 y de la sobreexpresión del extremo C-terminal de Bck1, la MAPKKK de esta ruta. Dichos ensayos, junto con experimentos de copurificación, nos permitieron identificar por primera vez a la tirosín fosfatasa Ptp1 como regulador negativo de las rutas de apareamiento e integridad celular gracias a su interacción con las MAPKs Fus3 y Slt2. Por otro lado, los experimentos de epistasis realizados en este trabajo mostraron que la serín-treonín fosfatasa Ptc1 regula negativamente la ruta de integridad celular actuando a nivel de las MAPKKs Mkk1 y Mkk2. Además, hemos comprobado la existencia de una relación genética positiva entre Mkk1 y Ptc1, que ha puesto de manifiesto que Mkk1 transmite la señal hacia Slt2 de forma más efectiva que Mkk2, no sólo en ausencia de Ptc1, sino frente a distintas condiciones de activación de la cascada. En definitiva, los datos presentados en esta tesis doctoral han generado nueva información sobre la regulación negativa que ejercen las proteín fosfatasas en las cascadas de señalización mediadas por MAPKs.