Caracterización físico-química y biológica de filmes de quitosano como trasnportadores de la rhBMP-2 en la regeneración del tejido óseo

Resumen

Gracias a las características de inocuidad, biodegradabilidad y biocompatibilidad el quitosano se ha convertido en un polímero natural de gran interés en el campo de la Ingeniería de tejidos. No obstante la ausencia de normas y métodos de obtención estandarizados dificultan su comercialización como sistema de liberación controlada de fármacos. En la actualidad es necesaria la realización de una caracterización físico-química exhaustiva que permita evaluar los parámetros más influyentes en las propiedades biológicas del mismo.En este trabajo se han desarrollado películas (filmes) de quitosanos como transportadores de la proteína recombinante humana morfogenética ósea 2 (rhBMP2) para la regeneración de tejido óseo. Para ello se han caracterizado los principales parámetros físico-químicos de 12 quitosanos diferentes (en peso molecular, grado de desacetilación e índice de cristalinidad) que van a influir en sus propiedades biológicas, así como también otras características que nos permiten trabajar de forma homogénea (como el contenido de humedad, cenizas e insolubles) y el contenido de metales pesados, indispensable para aplicaciones en biomedicina.Los filmes obtenidos por la técnica de evaporación de solvente fueron homogéneos transparentes y lisos, cuyos parámetros superficiales (topografía superficial, rugosidad, espesor y ángulo de contacto) revelaron ser superficies poliméricas adecuadas para las interacciones necesarias en los procesos celulares. Se observó una rápida cinética de hinchamiento a diferentes pHs, estando relacionado con la liberación de factores bioactivos. Los ensayos de degradación in vitro simulando las condiciones in vivo (con y sin enzima Lisozima a pH ácido y neutro presentes en la reparación de una herida) mostraron cinéticas más rápidas en presencia de enzima y medio ácido. En cambio sin enzima y en ese medio se observaron diferentes comportamientos en función del peso molecular. En medio pH neutro (con y sin enzima) los filmes presentaron una degradación muy lenta, revelando la gran estabilidad de los mismos en estas condiciones. Los filmes permitieron la adhesión y proliferación de la línea celular C2C12 mostrando como superficies óptimas para la proliferación celular los quitosanos de bajo peso molecular, alto grado de desacetilación y baja concentración de polímero. En cambio se obtuvieron mejores niveles de adhesión celular sobre filmes de mayor concentración y mayor peso molecular relacionado con una rugosidad más adecuada para las interacciones iniciales celulares. Los filmes cargados con proteína permitieron la liberación de la misma de forma activa produciendo la diferenciación de las células C2C12, mediante la detección de la actividad fosfatasa alcalina. Los ensayos de liberación in vitro se realizaron cuantificando la actividad fosfatasa alcalina de las C2C12 cultivadas con medios (DMEM completo) que estuvieron en contacto con los filmes a determinados tiempos. Se obtuvo un comportamiento exponencial de una sola constante de tiempo y sólo a dosis bajas se observó un proceso lineal. En todos los casos se detectó un efecto explosión (burst) en las primeras 24 horas. La liberación desde diferentes filmes también mostró ese comportamiento exponencial de una sola constante de tiempo excepto quitosanos de elevado peso molecular cuya liberación es muy rápida. Los demás quitosanos mostraron cinéticas similares entre ellos con una misma constante de velocidad y misma semivida. A través de los ensayos in vivo se comprobó la liberación de la proteína activa mediante tinciones histológicas y estudios de microtomografía computarizada, observando la formación de hueso ectópico en músculo de rata. El marcaje de la proteína con yodo 125 permitió localizar los sitios de retención de la misma en el organismo demostrando la capacidad de retención de la proteína en el filme hasta los diez días de ensayo y su excreción en las primeras 24 horas por vía renal.