Identificación, expresión y caracterización de peroxidasas ligninolíticas de interés en genomas de basidiomicetos

Resum

La secuenciación de los genomas de Pleurotus ostreatus y Ceriporiopsis subvermispora nos ha permitido investigar las propiedades bioquímicas, estructurales y operacionales de las diferentes hemoperoxidasas ligninolíticas presentes en dos hongos modelo de interés biotecnológico.La caracterización de las peroxidasas de clase II del genoma de P. ostreatus revela un repertorio formado por tres peroxidasas versátiles VPs y seis manganeso peroxidasas MnPs. Los estudios estructurales funcionales de las seis MnPs de P. ostreatus revelan que éstas constituyen una nueva subfamilia, caracterizada por su actividad independiente de Mn sobre algunos sustratos y por la presencia de una cola en el extremo C-terminal más corta que en las típicas MnPs largas. Se ha cristalizado el primer miembro de esta nueva subfamilia. Además, usando dímeros modelo y lignina sintética marcados radioactivamente se ha mostrado por primera vez la capacidad de las VPs para degradar la lignina, confirmando que la VP desempeña en P. ostreatus el papel desempeñando por la LiP en P. chrysosporium.Las isoenzimas muestran grandes diferencias en su estabilidad a la temperatura y al pH. La isoenzima más estable al pH y la más estable a la temperatura se cristalizaron. Para investigar el significado biológico de la duplicación de genes, se analizaron por RT qPCR las diferencias en su expresión cuando se modifican las condiciones de temperatura y pH en cultivos lignocelulósicos, en combinación con estudios proteómicos y medidas de actividad. Los genes de algunas de las enzimas más estables mostraron niveles de transcripción relativa mayores en las condiciones más extremas de pH y temperatura ensayadas. Estos resultados muestran una regulación ambiental de la expresión de las isoenzimas.El genoma de C. subvermispora mostró un número inusualmente elevado de MnPs, junto con genes implicados en la síntesis de ácidos grasos insaturados, sugiriendo su contribución en la degradación de la lignina a traves de los radicales derivados de la peroxidación de los lípidos. También se identificaron dos genes de una putativa LiP y una putativa VP, estos genes se expresaron y las proteínas obtenidas se caracterizaron bioquímicamente confirmando su capacidad de degradar directamente la lignina. Estos estudios confirman que los dos nuevos genes identificados corresponden a LiPs funcionales, que posiblemente representan formas de transición entre VP y LiP. En los últimos estudios de los genomas de basidiomicetos se ha diferenciado una nueva subfamilia de MnPs, denominada MnP extralargas. Los tres tipos están presentes en el genoma de C. subvermispora y se han caracterizado bioquímica y estructuralmente y se realizaron estudios de mutagénesis dirigida en la cola C terminal. La eliminación de la cola confiere a las MnPs largas y extralargas la actividad independiente de Mn que caracteriza a las MnPs cortas. Estos estudios concluyen que las MnP de tipo corto constituyen una subfamilia verdadera, con diferentes propiedades catalíticas y de estabilidad, mientras que las MnPs llamadas largas y extralargas no muestran suficientes diferencias para considerarse dos subfamilias diferentes. Una MnP extralarga extremadamente estable al pH ácido fue cristalizada, siendo la primera peroxidasa de este tipo de la que se obtiene la estructura molecular. Esta MnP se usó como una base robusta para, mediante la introducción de un triptófano catalítico, construir una peroxidasa de interés biotecnológico capaz de actuar a pH extremadamente ácido.Los resultados obtenidos en la presente tesis han permitido establecer la existencia de enzimas de tipo LiP en C. subvermispora y su ausencia en P. ostreatus, donde estarían sustituidas por VPs. Además se aporta la primera caracterización estructural-funcional de las MnP cortas, y muestran que las descritas como MnPs largas y extralargas no presentan suficientes diferencias para establecer dos subfamilias.