Alteraciones inducidas por cambios gravitatorios en células proliferantes en cultivo de "Arabidopsis thaliana"

Resumo

El cambio de la gravedad ambiental, único factor ambiental constante durante la evolución en la Tierra, desacopla la proliferación y el crecimiento celular en las células meristemáticas de plántulas de Arabidopsis. El objetivo de esta Tesis Doctoral es definir si estas respuestas gravitatorias son puramente celulares o dependen de la organización tisular, y para ello hemos utilizado un sistema modelo de cultivo celular in vitro de plantas de Arabidopsis thaliana, en el que no se conoce la presencia de estructuras especializadas para la gravisensibilidad, como los estatolitos, ni la de cascadas de señalización tisular, como el transporte de auxinas. Nuevos abordajes experimentales en este modelo in vitro permiten investigar la respuesta de las células individuales al estrés gravitatorio, concretada en los procesos de proliferación y crecimiento celular.Primero realizamos un estudio comparativo y sistemático de la idoneidad de varias instalaciones de microgravedad simulada en tierra (Ground Based Facilities - GBF), optando por la inclusión de las células en agarosa previa a su incubación en la Máquina de Posicionamiento Aleatorizado (Random Positioning Machine - RPM) para experimentos en microgravedad simulada, o en la Centrifuga de Gran Diámetro (Large Diameter Centrifuge - LDC), para experimentos en hipergravedad. Además, se han investigado nuevos modos de operación de la RPM (RPMHW y RPMSW) para obtener la gravedad parcial de la Luna y Marte.En cultivos asincrónicos in vitro de Arabidopsis, el crecimiento y la proliferación celular se desacoplaron de forma similar a lo observado en células meristemáticas de plántulas. Estas alteraciones fueron mayores en condiciones de gravedad reducida, pero más leves en hipergravedad. Se alteró la distribución de células en las fases del ciclo celular y se observaron cambios en la expresión de genes reguladores del ciclo celular, en la biogénesis de ribosomas y el número de nucleolos inactivos. Además, se detectó un aumento en la regulación epigenética de la expresión génica; más metilación del DNA y menos acetilación de histonas.En cultivos sincronizados por afidicolina en condiciones de gravedad 1g control, definimos un patrón ultraestructural concreto del nucleolo y de sus subcomponentes para cada fase del ciclo celular (más compactos en las fases G1, mayores en S e incluso vacuolados en G2 con niveles crecientes de proteínas nucleolares). En cultivos sincrónicos en microgravedad simulada, la actividad nucleolar se redujo sobre todo en la subpoblación G2/M. Además, la trascripción extra-nucleolar por la RNA polimerasa II se redujo y aumentó la cromatina condensada. Se demostró la aceleración del ciclo celular en gravedad reducida, esencialmente por la fase G2/M, de duración variable dependiendo de los niveles de gravedad, menor en hipogravedad y mayor en hipergravedad. Estudios transcriptómicos confirmaron que el punto de control G2/M es una diana clave para los efectos de la gravedad alterada; los reguladores del punto de control G2/M aparecieron claramente subregulados en microgravedad, mientras que la regulación del punto de control G1 se encontró levemente sobreregulada, permitiendo una recuperación parcial de la aceleración del ciclo originada en la transición G2/M. Además se observó una represión global de la transcripción y otros grupos GO afectados incluyeron genes de estrés abiótico y genes mitocondriales de función desconocida, que asociamos con una ruta de señalización nueva para la respuesta gravitatoria.En consecuencia, las células vegetales responden a la microgravedad a través de un mecanismo único y complejo; la activación diferencial de varias rutas del estrés ambiental sugiere un efecto sinérgico en diferentes subpoblaciones del ciclo celular.Finalmente, se han desarrollado cultivos transgénicos fluorescentes de Arabidopsis, que potenciarán el retorno científico de la ISS con experimentos in vivo en el futuro.