Desarrollo y validación de técnicas de diagnóstico de infección fúngica invasora

Résumé

La infección fúngica grave causa la muerte a 1,3 millones de personas anualmente. Se ha descrito que el diagnóstico temprano de la infección reduce la mortalidad asociada. Sin embargo, muchas de las técnicas actuales no permiten una respuesta rápida y varían en cuanto a sensibilidad y especificidad. Por ello, se necesitan nuevas aproximaciones que den respuesta en tiempos más cortos y que permitan realizar un diagnóstico diferencial cuando varios microorganismos causan el mismo cuadro clínico. En esta tesis, se han desarrollado herramientas basadas en PCR en tiempo real (RT-PCR) fácilmente transferibles al Sistema Nacional de Salud para el diagnóstico e identificación de especies de hongos de gran importancia médica.En el primer objetivo, se han diseñado herramientas para el diagnóstico diferencial de la neumonía fúngica oportunista en pacientes con SIDA (neumocistosis, histoplasmosisy coccidioidomicosis) y la coccidioidomicosis. Se desarrollaron dos ensayos, uno de ellos en formato múltiple para la detección simultánea de Pneumocystis jirovecii, Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans; y el otro para la detección de ADN de Coccidioides. Los cebadores y sondas específicas de tipo molecular beacon se dirigieron a la región ITS del ADN ribosómico de cada una de las especies. Ambas técnicas presentaron valores de sensibilidad y especificidad in vitro del 100% y coeficientes de variación del 3%. La validaciónde las técnicas en muestras clínicas de pacientes con infección probada presentó valores de sensibilidad y especificidad superiores al 90%. En el caso de la coccidioidomicosis, se comparó la utilidad de la RT-PCR con el cultivo microbiológico en un modelo murino de infección durante 14 días. Las técnicas mostraron una concordancia muy buena y evaluaron la progresión de la infección en el mismo sentido en hígado, bazo y pulmón. Sin embargo, la RT-PCR detectó una carga fúngica entre 10-1000 veces mayor que el cultivo microbiológico.En el segundo objetivo, se ha evaluado la utilidad de la RT-PCR y el análisis de curvas de fusión de alta resolución (HRM) para la identificación de hongos patógenos humanos. Lasherramientas de identificación molecular han ayudado a descubrir que muchas especiesclasificadas por los métodos morfológicos como una sola, son en realidad complejos deespecies. Además, algunas de estas especies presentan diferencias en cuanto a epidemiología, virulencia o sensibilidad a los antifúngicos. Por ello, se han desarrollado dos métodos de HRM para la identificación de especies del género Cryptococcus y el complejo Candida parapsilosis. Los procedimientos desarrollados permitieron la amplificación específica de regiones del ADN ribosómico, 100 pb de la región ITS de Cryptococcus y 70 pb de la región IGS-1 del complejo C. parapsilosis. La concordancia entre HRM y la identificación mediante secuenciación de las mismas dianas fue del 100%. Este método es sencillo, rápido y no requiere de una base de datos de secuencias fiable para su aplicación, lo que facilita su transferencia a los laboratorios clínicos.Finalmente, y dentro de este segundo objetivo, se analizaron regiones de microsatélites en tres genes (CDC3, HIS3 y EF3) de varias cepas de Candida albicans, responsables de infección recurrente, mediante HRM y electroforesis capilar. Ambas técnicas demostraron que las cepas responsables de los episodios de infección tenían un origen clonal a pesar de sus diferencias en la susceptibilidad a los azoles. Aunque el poder de discriminación mediante HRM (0,77) fue menor que mediante electroforesis capilar (0,92), el HRM permite un cribado de las cepas relacionadas de forma rápida y económica. Además, esta metodología permitiría el estudio de brotes y evita el uso de métodos de tipado complejos y de difícil implantación en los laboratorios asistenciales.