Effect of origin and culture conditions on the heterogeneity of pluripotent cell populations

Resumen

Las células pluripotentes son una poderosa herramienta para la medicina regenerativa y la manipulación genética. Sin embargo, aún se desconocen aspectos clave acerca de las condiciones óptimas para su identificación, aislamiento y cultivo in vitro. Por ello, en esta tesis se han analizado varios aspectos determinantes para la obtención de líneas celulares. Las células troncales embrionarias (ESCs) son uno de los tipos de células pluripotentes más empleado, pero aún se desconoce si las características embrionarias influyen en su aislamiento. Las técnicas de reproducción asistida han sido extensamente utilizadas en humanos y en animales. Sin embargo, la manipulación y el cultivo in vitro de los embriones se ha asociado con la aparición de alteraciones en los embriones que pueden dar lugar a síndromes y enfermedades durante la edad adulta. Por lo tanto, la técnica de técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides utilizando espermatozoides con ADN fragmentado (DFS-ICSI) en el ratón se ha utilizado como un modelo para generar embriones de -mala calidad- para la obtención de líneas de ESCs. Los embriones generados por DFS-ICSI mostraron un menor potencial para generar líneas de ESCs que los embriones producidos in vivo. Además, en pases tempranos, estas líneas obtenidas mediante DFS-ICSI mostraron diferencias en la expresión de ciertos genes. Sin embargo, en pases tardíos las ESCs in vivo y las procedentes de DFS-ICSI adoptaron perfiles de expresión génica similares. Además, se observaron otras alteraciones en los animales obtenidos mediante DFS-ICSI, como una reducción en la producción de esperma y en la fertilidad de los machos de la descendencia, y ciertas alteraciones en la expresión postnatal de un alelo sensible definido epigenéticamente, siendo esta modificación heredada transgeneracionalmente.Las condiciones de cultivo son otro factor crítico que afecta a la obtención de líneas celulares y a sus posteriores características, por lo que se ha analizado su efecto durante la obtención de líneas de ESCs. Se observó una posible sinergia entre la suplementación con -leukemia inhibitory factor- durante el cultivo embrionario in vitro y la adición posterior de otros factores de crecimiento presentes en un medio de cultivo específico de células germinales, que favorece la creación de nuevas líneas de ESCs. Por ello, la eficiencia de obtención de ESCs depende en gran medida del medio de cultivo. Del mismo modo, el transcriptoma está determinado por las condiciones de cultivo, ya que la expresión génica de las líneas de ESCs varió de acuerdo a los diferentes medios de cultivo empleados para su obtención. Además observamos la aparición de un estado similar a una célula germinal durante el proceso de obtención de ESCs.Por otra parte, las células multipotentes podrían mostrar también este estado similar a una célula germinal. Por ello se ha estudiado el gen específico del linaje germinal Dazl mediante un ratón transgénico Dazl-eGFP, analizando el desarrollo embrionario preimplantacional y los tejidos fetales, neonatales y adultos en busca de expresión de eGFP inducida por Dazl. Durante el desarrollo embrionario preimplantacional, Dazl-eGFP fue detectado desde el estadio de cigoto hasta el de blastocisto. Aunque la expresión de Dazl-eGFP se localizó principalmente en las gónadas durante el desarrollo fetal y en la edad adulta, también se detectó en otros tejidos como el intestino y la médula ósea, en los que existen poblaciones de células multipotentes. Por ello, el transgen Dazl-eGFP podría ser usado para explorar la presencia de células multipotentes en diferentes tejidos.Por último se ha establecido un sistema para obtener líneas celulares trofoblásticas a partir de biopsias embrionarias bovinas en icrogota sobre una superficie gelatinizada para facilitar una rápida adhesión, y se han analizado medios condicionados por diferentes líneas celulares como alternativa al co-cultivo evitando así el riesgo de condicionados