Patología cardiovascular y enfermedad renalbúsqueda de biomarcadores de riesgo y diagnóstico temprano a nivel proteómico y metabólico

Zusammenfassung

La Tesis Doctoral presentada aborda un problema de salud de elevada prevalencia en nuestro país y a nivel internacional como es la enfermedad renal crónica (ERC). En la práctica clínica actual existen una serie de limitaciones de cara a realizar un diagnóstico preciso de la misma y, particularmente, de modo temprano. Los marcadores clínicos tanto de presencia como de evolución de la enfermedad no cuentan con la especificidad y sensibilidad adecuada en estadios tempranos. En este contexto, el principal objetivo de la tesis es la búsqueda de nuevos marcadores de enfermedad renal crónica en fluidos biológicos accesibles como son la orina y el plasma, que sirvan de apoyo a un diagnóstico fiable, temprano y personalizado así como a un seguimiento de la misma. De modo particular, se han descubierto metabolitos marcadores de enfermedad cardiovascular asociada; patología de alta prevalencia en este grupo clínico ERC. Se empleó la Resonancia Magnética Nuclear (RMN), en la fase de descubrimiento, y la cromatografía líquida acoplada a espectrómetro de masas triple cuadrupolo por la metodología MRM, en la fase de validación. Un grupo de 7 metabolitos fue encontrado respondiendo particularmente a ERC en los estadios más avanzados (IV-V) por sí misma, en muestras de orina (Guanidoacetato, TMANO, Glutamato, AFAG, 5-Oxoprolina, Citrato y Taurina). 6 de los 7 metabolitos (Guanidoacetato, TMANO, Glutamato, AFAG, 5-Oxoprolina y Citrato), responden ya en los estadios iniciales de la ERC (I-II). Un panel específico de 4 metabolitos fue asociado a individuos con ERC con EAC (Leucina, Treonina, Citrato y Homocisteína). Se evaluó la respuesta de estos metabolitos en una fase de validación en muestras de plasma, encontrándose nuevos datos de metabolitos asociados a ERC en estadios avanzados (IV-V) (5-Oxoprolina, Leucina, Treonina, Glutamato, Citrato y Homocisteína). 2 de los 7 metabolitos responden a estadios iniciales de ERC en muestras de plasma (5-Oxoprolina y Glutamato). Sin embargo, tres metabolitos que en orina respondían a EAC en ERC (Leucina, Treonina y Homocisteína), en muestras de plasma responden a ERC por sí misma. Sólo se encontraron dos metabolitos en muestras de plasma que respondían cuando la EAC está asociada a ERC (Treonina y Citrato). Tras estos hallazgos donde dos de los metabolitos alterados están implicados en el catabolismo del Glutatión vía 5-Oxoprolina (5-Oxoprolina y Glutamato), se realizó un estudio de las tres enzimas implicadas en la catalización de las reacciones que dan paso a estos dos metabolitos, encontrándose éstas alteradas tanto en orina como en plasma de individuos con ERC: 5-Oxoprolinasa (OPLA), gamma-Glutamilciclotransferasa (GGCT) y Glutamato-cisteínaligasa (GSH). De modo complementario, se abordó un análisis diferencial de las proteínas de la orina de estos individuos con ERC con y sin EAC asociada por marcaje con iTRAQ LC MS/MS, en la fase de descubrimiento y cromatografía líquida acoplada a espectrómetro de masas triple cuadrupolo por la metodología MRM, en la fase de validación. Como proteínas alteradas en ERC avanzada se encontraron: KING1, CD59, PIGR, WAP, 8 AMBP y ?-2-MG. En los estadios iniciales de ERC encontramos RBP4. Cuatro proteínas fueron encontradas alteradas en respuesta a EAC: NID1, ZA2GP, KING1 y AMBP. En un intento de abordar la compresión de los mecanismos operantes en el desarrollo de la ERC, a nivel de tejido renal, se investigó el perfil metabolómico del tejido renal de rata con nefropatía diabética en un modelo temprano por la metodología 1HRMAS. Esta técnica no destructiva permite un análisis metabolómico directo del tejido. Su posterior análisis por la metodología MRM, dando como resultado 5 metabolitos alterados en tejido (Aldosterona, TMANO, Myoinositol, Glutamato y PDC).