Estudios epidemiológicos y moleculares sobre virus entéricos porcinos en Españaaplicaciones al diagnóstico del virus de la enfermedad vesicular del cerdo

Resumen

En el diagnóstico serológico de la enfermedad vesicular del cerdo (EVP) se dan con cierta frecuencia reacciones positivas falsas, que obligan a investigar la presencia del virus (VEVP) en heces por aislamiento en cultivo celular y posterior identificación por RT-PCR. Este procedimiento ralentiza el diagnóstico, lo que conlleva en muchos casos significativas pérdidas económicas a los ganaderos, que deben inmovilizar las explotaciones afectadas durante este proceso. En la vigilancia seroepidemiológica de la EVP que se hace en España (país libre de la EVP) se dan con frecuencia mayor de la esperada reacciones falsamente positivas al VEVP, al tiempo que es habitual aislar virus que no son EVP en heces porcinas de las explotaciones afectadas. En esta tesis se ha estudiado la naturaleza de estos virus mediante las técnicas moleculares disponibles y se han desarrollado herramientas diagnósticas que permitan distinguirlos del VEVP. Para ello se ha validado una técnica de RRT-PCR para todos los genotipos del Gº Teschovirus y se ha diseñado una técnica de caracterización de aislados víricos del Gº Teschovirus, basada en la amplificación por RT-PCR y posterior secuenciación de la región codificante de la proteína VP1, que ha permitido la clasificación de los aislados hallados y el reconocimiento de dos genotipos no conocidos (PTV12 y PTV14). A su vez, se ha demostrado por estudios experimentales que el aislado CC25 (PTV-12) era un nuevo genotipo y serotipo, no patógeno, con tropismo tisular por el sistema linfático y digestivo, e incapaz de conferir protección cruzada frente a una cepa heteróloga (PTV-1). Por otro lado, los estudios llevados a cabo han puesto de manifiesto la abundancia de teschovirus y sapelovirus en jabalíes, y su análisis ha permitido establecer las relaciones filogenéticas entre éstos y los aislados porcinos. Además, la diversidad de las comunidades víricas presentes en heces porcinas ha sido caracterizada mediante el empleo de la metagenómica. La falta de reactividad serológica de una colección de antisueros policlonales monoespecíficos en las técnicas para detección de anticuerpos (ELISA-FL y virus-neutralización) frente al VEVP ha demostrado que ninguno de los virus entéricos porcinos no vesiculares estudiados es el responsable de las reacciones falsamente positivas al VEVP observadas en nuestro país. Esta conclusión ha sido corroborada al observarse en muestras de campo una ausencia de correlación estadística entre los resultados serológicos frente al VEVP y frente al aislado español de teschovirus “CC77” (PTV-2). Asimismo, estudios preliminares han demostrado que la adición de anticuerpos neutralizantes específicos frente a los VEP-NV más abundantes identificados en nuestro país podría mejorar la técnica de aislamiento del VEVP, siendo necesaria su optimización para conseguir una mejora efectiva en el diagnóstico confirmatorio de la EVP. ABSTRACT.In the diagnosis of swine vesicular disease (SVD), false positive reactions occur occasionally, that prompt to investigate the presence of the virus (SVDV) in faeces by virus isolation followed by RT-PCR identification. This process delays the diagnostic, which in turn causes significant economic losses to the farmers, who are prevented from moving their livestock in the meantime. The SVD seroepidemiological surveillance carried out in Spain (SVD-free country), false positive reactions to SVDV are more frequent than expected, and, in addition, the isolation of viruses that are not SVDV in porcine faeces from the affected farms is common. The nature of these viruses has been studied in this thesis using molecular methods available and newly developed diagnostic techniques aimed at enabling a correct differential diagnosis of SVDV. To this aim, a RRT-PCR technique for the detection of all genotypes of Gº Teschovirus has been validated, and a method for the characterization of viral isolates belonging to this genus has been developed, based on the amplification and nucleotide sequencing of the VP1 protein-coding region of its genome, which enabled the classification of isolates found and the recognition of two as yet unknown genotypes (PTV12 and PTV14). In turn, experimental studies have shown that the isolate CC25 was a new genotype and serotype (PTV-12), nonpathogenic, showing tissue tropism for lymphoid and digestive systems and unable to confer cross-protection against a heterologous strain (PTV-1). Likewise, studies conducted in wild boar have shown the abundance of teschoviruses and sapeloviruses in faecal samples, and further analysis has allowed to establish phylogenetic relationships with their domestic porcine counterparts. In addition, the diversity of viral communities present in pig faeces has been characterized by using metagenomics. The lack of serologic reactivity of a collection of monospecific polyclonal antisera in the tests used for detection of antibodies to SVDV (ELISA-LP and virus-neutralization test) demonstrated that none of the non-vesicular porcine enteric viruses studied is responsible for the false-positive reactions to VEVP observed in our country. This conclusion was corroborated by the observed absence of statistical correlation between serological results obtained to VEVP and to the Spanish teschovirus isolates “CC77” (PTV-2) in field samples. Moreover, preliminary studies have shown that the addition of specific neutralizing antibodies to the most abundant VEP-NV found in our country, could improve the technique of VEVP isolation, though it requires an optimization to achieve an effective improvement in the confirmatory diagnosis of EVP.