Estudios moleculares del gen "IytA" de "Streptococcus pneumoniae", y otros estreptococos relacionados, y su aplicación en epidemiología

Resumen

El género Streptococcus incluye especies que se dividen en 5 grupos: ¿Mutans¿, ¿Salivarius¿, ¿Anginosus¿, ¿Sanguinis¿ y ¿Mitis¿ (Facklam, 2002). La separación entre los dos últimos grupos no es clara y por ello, en esta Tesis, se ha utilizado el concepto más extendido de ¿Estreptococos del Grupo Mitis¿ (SMG) que incluye a ambos grupos. Streptococcus pneumoniae (neumococo) es el patógeno humano más importante dentro de los SMG y se encuentra estrechamente relacionado con otros SMG comensales del tracto respiratorio superior y de la cavidad oral como Streptococcus mitis, Streptococcus oralis y Streptococcus infantis, los cuales raramente causan enfermedad (Maeda et al., 2011; Mitchell, 2011). La autolisis típica en la fase estacionaria y la solubilidad de en sales biliares es debida a la principal autolisina de neumococo, LytA, una N¿acetylmuramoyl¿L¿alalina amidasa (NAM-amidasa) (García et al., 1986) que constituye un importante factor de virulencia (Ramos-Sevillano et al., 2012, 2013). Otros SMG también sintetizan amidasas de tipo LytA pero, mientras que los alelos lytASpn presentan un tamaño de 957 pb, los lytASMG tienen 951 pb. Es importante resaltar que todos los profagos de neumococo descritos hasta la fecha, codifican una LytAPPH de 318 aminoácidos (Romero et al., 2009). Además, se han descrito dos bacteriófagos de S. mitis (phiB6 y phiHER) que también codifican una endolisina tipo LytA (LytASPH) de 318 aminoácidos, mientras que el profago EJ-1 de S. mitis presenta un gen con la deleción característica de los alelos lytASMG (Díaz et al., 1992). En esta Tesis se ha realizado un amplio estudio del polimorfismo del gen lytA (y de la proteína que codifica). Se recopilaron todas las secuencias del gen lytA disponibles en las bases de datos. Se compararon estas secuencias determinándose que el clado de alelos lytASPH era el más polimórfico, seguido de los clados lytAPPH y lytASMG, mientras que el clado lytASpn se encontraba bien conservado. En el mismo sentido, el polimorfismo de lytAPPH, lytASPH y lytASMG se encuentra distribuido a lo largo de todo el gen mientras que, en los alelos lytASpn, se encuentra localizado alrededor de tres posiciones nucleotídicas (453, 767 y 923) estando el polimorfismo más marcado alrededor de la posición 453. Así, los alelos lytASpn pueden clasificarse en dos familias (Fam_A y Fam_B) dependiendo de su secuencia concreta alrededor de dicha posición. Por otro lado, también se pudo observar que, alrededor de la posición 453, habían tenido lugar varios eventos de recombinación entre fago y bacteria. Estos datos indican que los genes fágicos pueden desempeñar un papel importante en la evolución de los genes bacterianos implicados en la enfermedad, como es el caso de la NAM-amidasa LytA. Con la intención de ampliar este estudio, se secuenció el gen lytA de 164 aislados clínicos. En total se encontraron 30 alelos lytASpn (que dan lugar a 15 alelos LytASpn). En este sentido, se determinó la presencia de fagos atemperados y la secuencia lytAPPH correspondiente en estos aislados clínicos encontrándose un total de 29 alelos. Una nueva búsqueda en las bases de datos reveló que los genomas de varias cepas de SMG que habían sido secuenciadas muy recientemente poseían genes lytA peculiares. Estos nuevos alelos residían en cepas de S. mitis, S. infantis y S. oralis y, en su mayoría, correspondían a genes lytA fágicos. Por otro lado, se observó que estas nuevas LytA eran muy divergentes de las descritas previamente. Estos datos, junto con la localización de las posiciones determinantes de especificidad en el modelo de la proteína propuesto en esta Tesis sugieren que los nuevos alelos LytA podrían presentar diferentes afinidades por el sustrato (pared celular) así como diferencias significativas en sus propiedades catalíticas. Finalmente, en esta Tesis se presentan evidencias experimentales que indican que el gen lytA forma parte de una isla de patogenicidad que incluye a ply, el gen que codifica la neumolisina.