Nuevos aspectos del control del metabolismo en "Pseudomonas putida" KT2440metabolismo del ácido fenilacético y papel del gen apaH

Resumen

Las vías metabólicas para la degradación microbiana de compuestos aromáticos (CA) y los circuitos reguladores que controlan su expresión han sido extensamente estudiadas. Por otra parte, el control que ejercen algunos compuestos aromáticos sobre el catabolismo de otros que utilizan rutas periféricas distintas es un tema poco estudiado en bacterias, y en ningún caso se ha abordado la posible regulación cruzada entre una ruta aeróbica híbrida, como la ruta del ácido fenilacético (AFA), y una ruta aeróbica clásica que involucra intermediarios catecólicos. El metabolismo de los CA supone cambios en los programas celulares básicos como el metabólico, morfológico y de estrés. Cómo se remodelan e integran estos programas celulares cuando se alteran los niveles de la alarmona Ap4A en la célula y la compleja red de regulación asociada se ha estudiado en esta tesis. Se utilizó la bacteria P. putida KT2440, ya que es un modelo de versatilidad y robusteza metabólica, en lo que hace referencia a los CA, y se dispone de amplios conocimientos de su fisiología, bioquímica, y genética, como de un modelo metabólico a escala genómica (iJN1411). Los objetivos específicos son: I) Estudiar la regulación cruzada entre la ruta aeróbica híbrida del AFA y las rutas aeróbicas clásicas del 4-hidroxibenzoato (4HBA) y galato en P. putida, II) Estudiar los efectos fisiológicos asociados a la inactivación del gen apaH en P. putida, III) Determinar las bases moleculares del remodelado de los programas morfológico, metabólico y de estrés y caracterizar el sistema de señalización/ regulación que responde a la inactivación del gen apaH en P. putida. Los resultados demostraron que el AFA ralentiza el consumo de 4HBA. El análisis de la expresión de los genes de la ruta del 4HBA permitió determinar que el efecto represor se ejerce a nivel transcripcional sobre los operones pcaGH, pcaRKF y pobA. Se determinó también, que el efecto represor es debido al metabolismo del AFA y que éste reprime la actividad de los promotores PT y PB que controlan los genes de la ruta del Galato. Mediante mutagénesis al azar obtuvimos una cepa mutante en el gen apaH (codifica la principal hidrolasa de la alarmona Ap4A en bacterias) que no presenta represión del AFA sobre el promotor PT, estarían involucrados en fenómenos de represión catabólica. La inactivación de este gen en P. putida, provoca efectos pleiotrópicos, ocasionando una reducción de la movilidad celular, de la producción de pioverdina y de la resistencia al estrés oxidativo, y por otro lado, un incremento de la formación de biofilm y resistencia al estrés osmótico, así como una característica fase de latencia extendida de los cultivos cuando se utilizan diferentes fuentes de carbono. de transcripción cuantitativa y de distribución de flujo utilizando el modelo metabólico, se confirmó a nivel molecular que la inactivación del gen apaH afecta tanto a los programas de estrés y morfológico como al programa metabólico. Una consecuencia principal de la inactivación del gen apaH en P. putida es el remodelado del metabolismo central y la inducción de isoenzimas poco habituales en la célula, lo que provoca un estado energético subóptimo que podría explicar la fase de latencia extendida así como otros fenotipos relacionados con los programas de estrés y morfológico. Se determinó, que el gen rpoS, que codifica el factor sigma alternativo RpoS de respuesta a estrés, parece desempeñar un papel central en la cascada de regulación que responde a la inactivación del gen apaH, y que implica también a los rsm sRNA y el sistema regulador global GacS/GacA en P. putida. Esta tesis abre campos de investigación futura sobre el papel de Ap4A como molécula señal central y como un elemento importante para el diseño de microorganismos con aplicaciones biotecnológicas.