Estudios de RMN y dinámica molecularreconocimiento molecular de carbohidratos por proteínas

Resumen

El reconocimiento de carbohidratos por lectinas, proteínas que selectivamente reconocen carbohidratos sin actividad enzimática o inmunológica, es un suceso ubicuo en los organismos vivos. Por esta razón, el interés por estudiar carbohidratos desde esta perspectiva ha aumentado en los últimos años. En particular, hemos destacado el uso combinado de experimentos de RMN con simulaciones de Dinámica Molecular y protocolos de modelado molecular como herramientas clave para diseccionar, a escala atómica, los elementos de unión clave de ligandos relevantes desde un punto de vista biomédico en sus superficies del receptor específico. Por consiguiente, en esta tesis, hemos empleado una combinación de STD, trNOESY y simulaciones de dinámica molecular como poderosas herramientas para obtener información importante acerca del reconocimiento molecular de oligosacáridos sintéticos frente a dos anticuerpos específicos IgG e IgM. Nuestro estudio ha dado evidencias experimentales de la importancia individual de los diferentes residuos, dependiendo de su posición en la secuencia oligosacarídica, también para oligosacáridos mas extensos, y su relevancia en el proceso de reconocimiento molecular. La información obtenida a partir de los experimentos de STD evidenció la directa implicación del residuo de RhaC seguido por sus residuos vecinos en todos los oligosacáridos sintéticos en presencia de ambos anticuerpos. Experimentos de trNOESY dieron información estructural de los valores torsionales mayoritarios para cada enlace glicosídico en el estado libre, además del equilibrio conformacional existente en el estado unido. Los datos obtenidos han indicado que estos procesos de reconocimiento molecular conllevan una selección conformacional. Cuando los N glicanos interaccionan con lectinas, la naturaleza del epítopo objetivo estrictamente depende de la naturaleza de la lectina estudiada, pudiendo seleccionar distintos determinantes de la cadena sacarídica del N glicano con exquisita especificidad, dependiendo de la presentación relativa de los diferentes residuos y de la arquitectura del sitio de unión. Hemos enfatizado la importancia de la coexistencia de sitios de unión de diferentes dominios de lectina para conseguir unión al glicano comparando un dominio único de heveína y WGA, un tetrámero. La unidad monomérica no reconoce el extenso glicano, con la ramificación en el residuo de beta Man siendo el elemento clave de descarte de la interacción. Por el contrario, la lectina multidominio WGA se une al extremo reductor de ambos N glicanos sialilado y no sialilado admitiendo la posibilidad de obtener interacciones estabilizantes entre sitios de uno de los dominios de heveína vecinos. Mediante estudios con VAA se obtuvo información acerca de cómo la alfa sialilación 2,6 puede ser acomodada por esta lectina, generando un incremento de la unión en N glicanos naturales cuando lo comparamos con el N glicano no sialilado correspondiente. La unión al extremo terminal LacNAc del N glicano sialilado es detectable, obteniéndose la referencia control para la unión positiva. También en esta tesis, hemos demostrado la capacidad de cuatro oligosacáridos relacionados con antígeno glycotope, relacionado con procesos de respuesta inmune, de interaccionar con diferentes fragmentos de anticuerpo scFv que se unen al glycotope. Usando experimentos de STD, hemos demostrado que la presencia del residuo 3 alfa DGal A es decisiva en el proceso de unión. Finalmente, también hemos demostrado que una variedad de glicodendrímeros funcionalizados con lactosa y con 6 sialil lactosa pueden ser fácilmente acomodados por Viscumina, una lectina modelo tóxica, mejorando la unión. Experimentos de RMN asistidos por modelado molecular permitieron la identificación de los rasgos de unión clave entre el azúcar y la lectina. El protocolo de modelado ha permitido sugerir un modelo estructural de las posibles interacciones multivalentes de estos ligandos con esta lectina.