Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2)producción y evaluación de su actividad osteoinductora "in vitro" e "in vivo"

Resumen

La Ingeniería de Tejidos es un campo de investigación emergente multidisciplinar. El objetivo de esta ciencia es reparar, reemplazar, mantener o mejorar la función particular de un órgano o tejido. Su objetivo es crear sustitutos biológicos para su implantación en el organismo. Idealmente estos implantes combinan tres pilares básicos como son el uso de células vivas, factores bioactivos que dirijan la respuesta celular y matrices extracelulares que funcionen como soporte de los anteriores. Entre los factores bioactivos se encuentra la proteína morfogenética ósea 2, BMP2. Esta proteína pertenece a la familia TGFbeta y se caracteriza por su alta capacidad osteoinductora.En este trabajo se han estudiado alternativas para mejorar, simplificar, incrementar y economizar la producción de BMP2 recombinante humana biológicamente activa mediante su expresión en Escherichia coli. Posteriormente se ha evaluado su actividad biológica en estudios in vitro sobre distintos tipos celulares y se ha incorporado la proteína sobre soportes cerámicos para evaluar su actividad in vivo y como consecuencia su posible aplicación en clínica.En el proceso de producción de rhBMP2 se ha conseguido aumentar el rendimiento mejorando la pureza del proceso previo al plegamiento de la proteína. Esto permite disminuir también los costes debido a la reducción de los volúmenes de las fracciones intermedias en la producción. Además se ha determinado el tiempo de plegamiento idóneo para conseguir mayor cantidad de proteína biológicamente activa. Por un proceso de lisis enzimática se ha obtenido una forma sin extremo N terminal de la proteína que parece tener mayor actividad biológica en estudios in vitro. La rhBMP2 producida induce la diferenciación hacia el fenotipo osteoblástico de células mioblásticas, C2C12, y estimula dicho fenotipo en aquellas de linaje óseo. En estudios in vitro con células madre mesenquimales humanas, hMSC, se ha observado que la rhBMP2 puede afectar al crecimiento celular cuando es administrada en un corto periodo de tiempo, 7 días, y promueve de forma más significativa la diferenciación osteoblástica en células con menor número de subcultivos. Además el aporte continuado de rhBMP2 sobre hMSC desencadena la expresión de marcadores osteogénicos. Sin embargo este trabajo demuestra que en condiciones in vitro la rhBMP2 por sí sola no es suficiente para inducir la mineralización de hMSC sino que es necesario el aporte de otros factores como dexametasona y fosfatos inorgánicos.Se ha comprobado que el efecto de la rhBMP2 sobre hMSC no es permanente, es decir, es necesario un aporte continuado de dicha proteína para mantener la diferenciación de las células hacia el linaje osteoblástico. Esto mismo se observa sobre células C2C12 en las que una vez retirado el tratamiento de rhBMP2 volvían a recuperar la expresión de marcadores mioblásticos y disminuían los osteoblásticos inducidos por dicha proteína.Por último se ha incorporado la rhBMP2 a cerámicas fabricadas mediante el proceso de robocasting. Se ha demostrado la biocompatibilidad de estas estructuras en estudios in vitro por microscopia y por ensayos colorimétricos de proliferación. Además, mediante la incorporación de rhBMP2 tanto en la superficie de la cerámica como utilizando un transportador como el quitosano para controlar su liberación, se ha dotado a dichas estructuras de actividad osteoinductora comprobada tanto en estudios in vitro como en diferentes modelos animales. Así las cerámicas con rhBMP2 han inducido la formación de tejido óseo en una localización ectópica en conejos y han promovido el crecimiento óseo en pequeños defectos en tibia de conejo. A su vez se ha empleado un modelo quirúrgico en cerdos para demostrar su idoneidad para aplicación en clínica comparándolas con un material ya comercializado. Se ha demostrado mediante técnicas de imagen e histológicas sus propiedades osteoconductivas y osteoinductivas.