Inhibidores sintéticos de FtsZ con actividad antibacteriana

Resumen

El objeto principal de esta Tesis doctoral fue la proteína de división celular procariota FtsZ que se localiza tempranamente en el sitio de la citoquinesis y polimeriza formando una estructura en forma de anillo (anillo Z). El anillo Z marca el sitio donde ocurre la división celular bacteriana, está presente durante todo el proceso y sirve como anclaje a las demás proteínas que participan en la división celular. FtsZ es homóloga de la tubulina, la proteína que forma los microtubulos eucarióticos. Ambas proteínas son GTPasas que polimerizan en presencia de GTP y magnesio. FtsZ consta de dos dominios globulares separados por una hélice central: el dominio N-terminal o dominio de unión al nucleótido y el dominio C-terminal implicado en la activación de la actividad GTPasa de la proteína. Por su papel esencial en la división celular bacteriana y su ubicuidad, FtsZ es una diana atractiva para el desarrollo de nuevos antibióticos. Se han descrito muchos compuestos que interaccionan con FtsZ; algunos de ellos tienen una potente actividad antimicrobiana frente a patógenos humanos y son eficaces en modelos de infección in vivo. En el presente trabajo se estudiaron los dos sitios principales de unión de ligandos en FtsZ: el sitio de unión del nucleótido y el sitio de unión del ligando PC190723 (PC), éste último se localiza en una hendidura profunda entre ambos dominios de la proteína. Por un lado se realizó la búsqueda de inhibidores de FtsZ con estructura química distinta del GTP y que se unieran al sitio de unión del nucleótido para posteriormente determinarse su mecanismo de acción molecular y celular. Por otro lado se exploró el sitio de unión de PC estudiando dos de sus fragmentos y un análogo. Para el abordaje de esta investigación se emplearon distintas técnicas bioquímicas, celulares y computacionales. En relación los inhibidores que tienen como diana el sitio de nucleótido de FtsZ, se comprobó que los derivados de GTP sustituciones en el carbono 8 se unen al sitio del nucleótido de FtsZ de una especie bacteriana, B.subtilis (Bs-FtsZ) y de una arqueobacteria, M.jannaschii (Mj-FtsZ) con afinidades similares. En Bs-FtsZ existe una correlación entre la capacidad inhibitoria de los ligandos y su afinidad de unión al sitio de nucleótido. Experimentos de resonancia magnética nuclear mostraron que existen diferencias en los epítopos de unión de los ligandos a ambas proteínas. Por otro lado se identificaron algunos compuestos polifenólicos que se unen al sitio del nucleótido de Bs-FtsZ con afinidades medio-altas. In vitro los ligandos inhiben el ensamblaje de Bs-FtsZ y conducen a la formación de polímeros desordenados o agregados de proteína, mientras que in vivo alteran la formación del anillo Z e inhiben la división celular de B.subtilis. Posteriormente se llevaron a cabo modificaciones en la estructura química de uno de estos ligandos (UCM05) obteniéndose nuevos compuestos con mayor afinidad de unión al sitio de nucleótido de Bs-FtsZ y mejor actividad antimicrobiana. Finalmente se llevó a cabo un exploración del sitio de unión del ligando PC190723. Se comprobó que PC se une a FtsZ de especies susceptibles promoviendo su polimerización. El fragmento principal del compuesto es diflorometoxibenzamida (DFMBA) ya que conserva el efecto inductor sobre la polimerización de FtsZ del PC190723 y disminuye la actividad GTPasa de la proteína. Se sintetizaron compuestos derivados de PC190723 a los que se añadieron distintos fluoróforos. Se identificó una sonda fluorescente (DFMBA-NBD) que se une específicamente al sitio de PC y varía su anisotropía de fluorescencia entre su forma libre y unida a la proteína. Este resultado indica que es posible desarrollar un método de fluorescencia para detectar y caracterizar la unión de compuestos a sitio de PC190723 usando la sonda fluorescente identificada.